糸状菌をホストとする植物アルカロイド生物合成システム

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25670046
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Iwate Medical University
• Principal Investigator: 藤井 勲 岩手医科大学, 薬学部, 教授 (70181302)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浅野 孝 岩手医科大学, 薬学部, 助教 (10552888) ; 橋元 誠 岩手医科大学, 薬学部, 助教 (80552893)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 生合成 / アルカロイド

Research Abstract

二次代謝産物生産性の高い糸状菌を宿主とした有用植物アルカロイド生物合成システムの構築を目指し、種々のベンジルイソキノリン系アルカロイド生合成の共通前駆体であるレチクリンを第一のターゲットとして、研究を開始した。出発前駆体であるチロシンは宿主とする麹菌Aspergillus oryzaeにより十分供給可能である考え、チロシンから最初のベンジルイソキノリン骨格化合物であるノルコクラウリン生成までに必要な生合成酵素遺伝子として以下の4遺伝子、A. oryzaeのtyrosinase遺伝子とmonoamine oxidase遺伝子、ケシ由来tyrosine decarboxylase遺伝子、オウレン由来norcoclaurine synthase遺伝子を選択した。植物由来の遺伝子については、麹菌にコドン至適化した遺伝子を合成した。各遺伝子を誘導発現用α-アミラーゼプロモーターの下流に導入し、これを栄養要求性マーカーの異なる4つのベクタープラスミドに組み込んで、各発現プラスミドを構築した。次いで、宿主として用いる4重栄養要求性A. oryzae NSAR1株に発現プラスミドを生合成反応順に組合せて形質転換を行った。プロトプラスト-PEG法による形質転換によって得られたA. oryzae NSAR1形質転換株について、ゲノムDNAを鋳型にしたPCRにより導入遺伝子のゲノムへの組込確認を行った。現在のところ、一部、所望の形質転換株で得られていないもあるが、これまでに得られた形質転換株について、誘導発現培養を行い、導入遺伝子の発現により生産が期待されるdopaおよびdopamineについて、その生産、蓄積を分析中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初計画を少し変更し、A. oryzae多重栄養要求性株を宿主として、チロシンから最初のベンジルイソキノリン骨格化合物であるノルコクラウリン生成までに必要な4つの生合成酵素遺伝子を順にゲノムに組み込むことを計画した。遺伝子の調製や合成、および発現プラスミドの調製までは順調に進んだが、A. oryzae多重栄養要求性株への形質転換で思うように形質転換体が得られず、時間がかかってしまった。

Strategy for Future Research Activity

これまでに得られた形質転換体について、導入した各遺伝子の働きによる生産物をHPLCで解析することにより、確認する。機能確認ができなかった遺伝子については、再度、形質転換体を調製し、確実に発現している株を選択する。ノルコクラウリン生成までに必要な4つの生合成酵素遺伝子の発現確認とノルコクラウリンの生産確認を当面の目標として、研究を進める。ノルコクラウリンの生産が確認できれば、ノルコクラウリンからレチクリン生成までに必要な3つのメチル基転移酵素遺伝子を合成し、これまでに作成した発現プラスミドに追加導入することにより、全７遺伝子を組み込んだ形質転換体の取得を目指す。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

研究室で購入済みの遺伝子工学用試薬を主に使用したため、新規購入した試薬類が少なかった。
次年度の遺伝子工学用試薬の購入に充当する。

Research Products

• [Remarks] 岩手医科大学薬学部・天然物化学講座ホームページ
  • URL: http://inpc.iwate-med.ac.jp/iNPC_IMU/HOME.html