2013 Fiscal Year Research-status Report
UV損傷の再検討ーDNA中ピリミジン塩基の光水和反応について
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25670064
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Nihon Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
根岸 和雄 日本薬科大学, 薬学部, 教授 (70116490)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 道夫 日本薬科大学, 薬学部, 准教授 (50349578)
根岸 友恵 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (80116491)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 紫外線 / 水付加 / ピリミジン / DNA / RNA |
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| Research Abstract |
重水中の紫外線照射によるシトシン５位水素の重水素への置換を指標として光水付加反応をモニターするプロジェクトについては、紫外線照射したデオキシシチジンを用いて NMR のデータ とTOF-MSのパターンを比較した。その結果、NMRの結果から予想される比率に対応した割合で質量数が１多いピークがTOFMSチャート上で観察された。このことから、TOFMSにより重水素交換反応を推定できる可能性が示唆された。そこで、まずDNAを重水中で紫外線照射し、酵素消化してヌクレオシドとした後、TOFMSを行ってデオシキシチジンの質量変化を分析したが、確定的な結果は得られなかった。そこで、より明確な結果を得るため、および紫外線によるピリミジン二量体生成の影響を排除する目的も兼ねて隣り合ったピリミジン塩基を持たない配列のオリゴヌレオチドを用いた実験を行った。これを重水中で紫外線照射し、酵素消化後TOFMSで分析すると、デオキシシチジンのピークにおいて、紫外線照射に伴って質量数が１多いピークが出現することが示された。これによりTOFMSによる水付加反応評価が可能であることが示された。また、ピリミジン二量体とは無関係に重水素置換が起きることも示している。より安定なウラシル、チミン付加体を含むヌクレオシドトリリン酸の性質を調べる研究は、本年は収率が高いUTPを用いる実験を行った。UTPに紫外線照射を行ってほぼ100%水付加体（hohUTP）となったサンプルを用意し、試験管内RNA合成系にUTPの代わりに加え、RNA合成が起こるかどうか調べたところ、RNA合成は全く起こらなかった。そこで、種々の割合でUTPとhohUTPを加えた系でRNAを行い、生成物を電気泳動で解析したところ、正常サンプルとは異なる泳動パターンを示す生成物が観察された。これは、hohUTPが取り込まれ異常なRNAができた可能性を示す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は２つの課題を設定している。一つはDNA中でのシトシン塩基に対する紫外線による水付加反応をモニターする方法の開発である。我々は使用法が簡便なTOFMSの利用を計画した。その結果、DNAレベルではまだ成功していないが、その一部の構造を取り出したと考えられるオリゴヌクレオチドで方法の有用性を確認することができた。もう一つはより安定なウラシル（チミン）型のヌクレオチドを用いてトリリン酸レベルで性質を調べる研究である。こちらは、チミン型はひとまず置き、収率が高いウラシル型の物質であるUTPについて実験を行い、RNA合成系での挙動を詳しく調べることができた。以上のように、実行できていない項目もあるが最重要の項目について進展しているので、おおむね順調と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
オリゴヌクレオチドの実験をふまえて、重水中でDNAを紫外線照射し、デオキシシチジン５位の重水素交換を測定する方法の確立を進める。UTPの生成物についてはRNA中に取り込まれたかどうかをきちんと評価したい。その他の点については、当初の計画通りに研究を進める。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
DNA合成系を用いた実験を行わなかったため、試薬品費等が未執行となったため
DNA合成系を用いた実験を行って使用する。
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