2013 Fiscal Year Research-status Report
尿毒症物質産生阻害薬探索のためのヒト人工多能性幹（iPS）細胞由来肝細胞の構築
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25670080
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
齋藤 秀之 熊本大学, 医学部附属病院, 教授 (40225727)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
城野 博史 熊本大学, 医学部附属病院, 准教授 (40515483)
白木 伸明 熊本大学, 学内共同利用施設等, 助教 (70448520)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 尿毒症物質 / インドキシル硫酸 / iPS細胞 / 肝細胞 / 代謝スクリーニング / 腎障害 |
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| Research Abstract |
本研究計画では、硫酸抱合型尿毒症物質の肝臓産生系をターゲットとし、ヒト人工多能性幹（iPS）細胞由来肝細胞モデルによる尿毒症物質産生阻害薬物のスクリーニング技術を独自に構築・開発し、腎機能障害並びに尿毒症治療効果を有するシーズ薬物を創出することを目的としている。研究分担者・白木らは、種々の肝臓分化方法を既に開発していが、従来の方法では、ヒトiPS細胞から肝臓を分化誘導することは可能であるが、成熟化した状態で細胞を維持培養することは技術的に困難であった。そこで、平成２５年度はこの問題点に対して培養液および培養プレートの至適化を検討し解決を図った。培養液の選定に関しては、マウス・ラットおよびヒト初代培養肝臓細胞を用いた研究において使用されている培地を参考に作成した。培養プレートについては、ヒト凍結肝細胞の機能維持に効果があることが報告されている３次元培養プレートCell-able（トランスパレント）を使用した。最終的に、ヒトiPS細胞(Toe)からCYP3A4活性を有する成熟した肝臓細胞を分化誘導することに成功した。更に、研究代表者・齋藤らは分化肝細胞においてインドールを添加培養することにより硫酸抱合型尿毒症物質であるインドキシル硫酸が産生されることを確認した。本iPS細胞由来肝細胞は、ヒト肝臓におけるインドキシル硫酸の産生活性を評価・解析すると共に、インドキシル硫酸産生の阻害薬物を網羅的に探索するうえで有用なスクリーニング系であることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成２５年度は、当初は培養系の改変と凍結保存技術の開発を行うことを計画・予定していた。尿毒症物質（インドキシル硫酸）産生能を有する肝臓細胞の分化誘導技術の開発については初年度で完了し、次年度の研究計画に向けた試験基盤ができたと考える。一方、分化誘導後の凍結保存については、検討したものの解凍後の生存率が悪く、改良法に関する更なる検討が必要であるため、次年度の研究課題として一部持越すこととした。凍結保存に関しては、補助的な位置づけであるため、本年度の目標であるiPS細胞の改変によるスクリーニングに利用可能なヒト肝臓細胞を作成することに関しては、おおむね達成した判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究初年度において、スクリーニング系に利用するiPS細胞由来ヒト肝臓細胞の作製に成功したことから、今年度は本細胞系を用いた尿毒症物質産生阻害薬物の探索試験を実験計画に沿って展開する予定である。具体的には、これまで別の実験系でインドキシル硫酸産生阻害効果を確認している候補化合物・薬物を用い、本実験系における阻害効果を比較検証する。本実験は、未解明の尿毒症物質の肝産生における動物種差を検証するうえで重要である。また、大規模な化合物スクリーニングにも利用可能とするために、分化誘導方法を改善・見直し、肝臓細胞作製にかかるコストの抑制方策についても取り組むことを予定している。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成２５年度は、ヒト肝増細胞培養系の改変と凍結保存技術の開発を行うことを計画・予定していた。尿毒症物質（インドキシル硫酸）産生能を有する肝臓細胞の分化誘導技術の開発については初年度で完了し、次年度の研究計画に向けた試験基盤が概ね完了した。一方、分化誘導後の凍結保存法の確立については、検討したものの解凍後の生存率が悪く、改良法・改善策の検討に時間等を要し一部予定通り展開できない試験が残ったため次年度使用額が生じた。次年度の研究計画の中に、成熟化前の肝細胞凍結保存技術について検討を含める予定である。
成熟化前の細胞を凍結保存し、解凍後に成熟化しスクリーニングを行うこと、iPS細胞から分化誘導した肝臓前駆細胞を凍結保存する技術を開発するための経費として次年度使用額を活用する。具体的には、細胞凍結液に関しては、市販されている様々な溶液を比較検討して、当該細胞の凍結保存に最適な凍結保存液を決定する。さらに、凍結保存の操作については、急速冷凍法および緩慢凍結法を比較検討するとともに、幹細胞の凍結保存時の生存率上昇に効果のあるRock inhibitorについても効果を比較精査する。
凍結保存細胞の解凍および成熟化技術の開発を目指し、ヒト凍結肝細胞で使用されている解凍専用の培養液の効果を検討する。幹細胞の解凍後の生存率上昇に効果のあるRock inhibitorについても効果を検討するとともに、成熟化に関しては同様の検討を行い最適な培養方法を決定する。
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[Journal Article] A synthetic nanofibrillar matrix promotes in vitro hepatic differentiation of embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.2013
Author(s)
Yamazoe T, Shiraki N, Toyoda M, Kiyokawa N, Okita H, Miyagawa Y, Akutsu H, Umezawa A, Sasaki Y, Kume K, Kume S.
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Journal Title
J Cell Sci.
Volume: 126
Pages: 5391-5399
DOI
Peer Reviewed
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