2013 Fiscal Year Research-status Report
内因性酸化LDL阻害因子の同定とその動脈硬化性疾患制御機構の解明
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25670133
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
垣野 明美 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 研究員 (00534637)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 酸化LDL / 酸化LDL受容体 / 動脈硬化 |
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| Research Abstract |
酸化LDL－酸化LDL受容体相互作用は動脈硬化の進展に重要である。動脈硬化制御の試みは、これまで酸化のプロセスを追いかけていた。これに対して本研究では、リガンドである酸化LDLを標的とする内因性ブロッカーの探索とその作用機序解明を目的としている。今回我々は、酸化LDLの内因性阻害因子としてDel-1を同定した。さらに作用機序について以下の検討を行った。
1. Del-1と酸化LDLの結合をELISAにより評価した。また、酸化LDLの細胞への取込みに対するDel-1の影響を検討した。Del-1は酸化LDLに結合し、LOX-1やSR-A、CD36、SR-BIといった一群の酸化LDL受容体発現細胞、および酸化LDL受容体を内在性に発現するヒト培養血管内皮細胞（HUVEC）やマクロファージへの酸化LDLの取込みを阻害した。さらに、Del-1に部位特異的変異を導入した蛋白質を作製して解析を行い、酸化LDL取込み阻害作用に重要なアルギニン残基を明らかにした。
2. Del-1が酸化LDLによって起こる細胞反応に与える影響を、LOX-1安定発現細胞株やHUVECを用いて評価した。Del-1は、LOX-1安定発現細胞で酸化LDLによるERKリン酸化や、転写因子NF-κBとSRFの活性化を抑制した。またHUVECでは、Del-1は酸化LDL依存的なERKリン酸化やエンドセリン-1分泌を抑制した。
3. Del-1を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製し、高脂肪食負荷によって生じる大動脈弁基部への脂質沈着の解析を行った。対象の野生型マウスと比較して、脂質沈着が減少することがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は、酸化LDL作用を阻害する内因性因子の存在を明らかにし、その作用機序の解明を目指した。in vitroでの解析の結果、Del-1が酸化LDL阻害作用を有することを見出し、酸化LDLの細胞への取込みや、酸化LDLによって起こる細胞応答を抑制することを明らかにした。さらに遺伝子改変マウスを用いた解析により、Del-1過剰発現は、高脂肪食負荷によって生じる血管壁脂質沈着に対して抑制的に働くことがわかった。このような結果から、順調に研究は進行していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養細胞やリコンビナント蛋白質を用いた解析は順調に進展していることから、平成26年度は当初の計画通り、引続きマウス個体レベルでの検証を進める。
高脂肪食負荷を行ったDel-1Tgマウスから大動脈血管を摘出して全RNAを抽出・精製し、血管内皮細胞機能に関連する因子について、定量RT-PCR により解析する。この解析により、in vivo における血管内皮細胞の病的機能変化に対して、Del-1 がどのように作用しているかを考察することができると考える。
また、Del-1 の血中濃度・発現量（ELISA・免疫染色・定量RT-PCR）と酸化LDLの血中濃度（ELISA）を調べ、これらの血中濃度・発現量の変動や相互のバランスが、動脈硬化の発症や進展にどのように影響し得るのかを検討する。
さらに、Del-1以外の内因性酸化LDL阻害因子を明らかにしたい。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究は、培養細胞を用いたin vitro の実験と、遺伝子改変動物を用いたin vivo の実験からなる。そのため、細胞培養に必要な器具試薬、動物実験に必要な実験試料に使用している。
培養細胞およびマウス個体レベルでの解析のために、培養試薬、ELISAキットや抗体、定量PCRに用いる試薬等を購入する。研究成果報告として、学会にも参加する予定である。
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