2013 Fiscal Year Research-status Report

進行性家族性肝内胆汁うっ滞(PFIC)におけるflippaseの作用機序の解明

Research Project

Project/Area Number	25670165
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	高津宏之京都大学, 薬学研究科(研究院), 研究員 (70360576)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords	P4-ATPase / ATP8B1 / PFIC / フリッパーゼ
Research Abstract	①PFICの原因となるATP8B1の変異体の作製し、HeLa細胞での安定発現株を樹立した。 ②作製した変異体の安定発現細胞株を用いて、ホスファチジルコリン(PC)に対するフリッパーゼ活性を調べた。進行性家族性肝内胆汁うっ滞(PFIC)および、より症状の軽い良性反復性肝内胆汁うっ滞(BRIC) の原因となるATP8B1の変異のうち8つを選定し、そのウィルス発現ベクターを作製し、HeLa細胞で発現させた。その結果、多くの変異体は本来、局在すべき細胞膜には局在できずに分解されてしまうことが確かめられた。その中で、L127P、I344Fの二つの変異体は、野生型と同程度に細胞膜に局在することが新たに分かった。そこで、これらの変異体のフリッパーゼ活性を測定したところ、野生型で見られたPCに対するフリッパーゼ活性が欠失していることが明らかとなった。この結果から、PFIC1が発症する分子メカニズムは主に2つの原因に分けられることが推察された。一つはATP8B1のタンパク質自体がうまく発現できないために発症に至る場合で、もう一つは発現はするものの変異によってPCに対するフリッパーゼ活性が欠失しているがために発症に至る場合で、いずれにしてもATP8B1が正常に機能できないために発症する。これまでのところ、我々が考えるモデルは以下のとおりである。 ATP8B1が発現する微小胆管の膜は細胞膜であり、リン脂質2重膜の外葉に偏ってPCが存在していると考えられる。分泌される胆汁酸はPCを主体としたリン脂質によって保護されているが、そのPCの供給源となっているのがATP8B1が外葉からフリップしたPCではないだろうか。ATP8B1が外葉のPCをフリップし、それを受け取ったABCB4とABCB11が協調して、細胞内からPCと胆汁酸を分泌する。現在は、このモデルの正当性を検証すべく、実験を進行中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初計画していた二項目、 ①PFICの原因となるATP8B1の変異体の作製と安定発現株の樹立 ②作製した変異体の安定発現細胞株を用いたフリッパーゼ活性の検出いずれも計画通りに遂行できたため。
Strategy for Future Research Activity	これまでの結果から、胆汁の分泌におけるATP8B1の機能に関して、ATP8B1がPCのフリッパーゼであるという観点から新たなモデルを提唱したい。そのために、胆汁の分泌に際して協調して働くPCのフロッパーゼであるABCB4と胆汁酸のトランスポーターであるABCB11との関係に着目し、ATP8B1との機能的相互作用を中心に実験を進める計画である。