2013 Fiscal Year Research-status Report
心筋細胞における筋原線維の同期的収縮を支えるT管の分子機構の解明
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25670171
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
阪本 英二 独立行政法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40291067)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 心筋細胞 / 同期的収縮 / T管 / 分子機構 / 心不全 |
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| Research Abstract |
本研究は、心筋細胞内の電気的収縮を同期させるT管が、筋形質膜から陥入して筋原線維のZ線へ架橋され、その破綻が心臓病に及ぼす影響を明らかにすることである。
T管は、横紋筋細胞の表面に生じた電気的興奮を瞬時に内部へ伝え、全ての筋原線維の収縮を同時に誘発させると考えられている。近年、単離心筋細胞のT管を薬物処理で非特異的に破壊すると、電気刺激で誘発される細胞内部の電位上昇は膜直下に比べ内部では有意に遅延することが実証されつつある。しかし、心筋におけるT管とZ線の架橋分子機構に関する詳細な報告はなく、その解明は心臓病治療に対する新たな戦略的見地からも極めて重要である。
そこで申請者らは、T管とZ線の架橋分子機構に関する新知見を得るべく、遺伝性心筋症のモデル動物である心筋症ハムスターに着目した。心筋症ハムスターは突然変異動物であるが、興味深いことに、重症度の異なる複数の亜系統が存在する。申請者らは先に、いずれの系統にも共通する遺伝的原因として、ジストロフィン結合タンパク質（DAPs）の一つであるδ-サルコグリカン（δSG）が欠損していることを明らかにした。さらに、中でも特に重症なTO-2ハムスターでは心室筋のZ線とT管が崩壊することも見出した。こうした事実から申請者は、TO-2にはδSGの遺伝的欠損に加え、T管とZ線の架橋に関わる分子にも第２の遺伝子異常が存在するのではないかと考えた。
本研究では、心筋のT管とZ線に局在するタンパク質群に焦点を当て、TO-2ハムスターの心臓においてT管とZ線の崩壊に相関して消失する分子を探索する。さらに、各分子間の架橋関係を明らかにし、これらT管とZ線の架橋分子群が心筋の同期的収縮において果たす分子的役割の解明も目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請者らはZ線に局在することが知られているタンパク質を対象とし、TO-2ハムスターの心筋において発現が低下あるいは消失するものをイムノブロットでスクリーニングした。その結果、中間径フィラメントであるデスミンは、TO-2ハムスターの加齢と共に減弱することを見出した。そこで、正常ならびにTO-2ハムスターのデスミンcDNAを単離・解析したところ、TO-2ハムスターではコーディング領域の571番目の塩基がGからAへ変化しており、これは191番目のアミノ酸をアラニンからスレオニンに変える点変異（Ala191Thr）であることが分かった。このアミノ酸変異はデスミンのコイル-１領域に存在し、ヒトでこれに相当するデスミンの変異は遺伝子情報データベースには報告されていなかった。
次に、この点変異がデスミン分子の線維形成にどのような影響を与えるかを調べるために、正常と変異デスミンのcDNAを、中間径フィラメント分子が発現してないSW13細胞にトランスフェクションした。変異デスミンの場合、線維形成は認められたが、正常に比べ明らかに細く疎らであった。この第２の遺伝子異常（Ala191Thr）はデスミンのダイマー形成に必須なコイル-１ドメインに軽度の構造変化をもたらし、それが集積されることでデスミン線維全体の形成にも障害を生ずるものと考えられた。
一方、δ-サルコグリカン（δSG）の心筋細胞内の局在を免疫染色で詳細に検討したところ、正常ハムスターの心筋では従来報告されている筋形質膜に加えT管にも存在し、Z線上のデスミンと共局在していることが分かった。またTO-2ハムスターでは、T管のδSGは欠損し、Z線上のデスミンは激減していた。
以上のことから、正常心筋ではT管のδSGとZ線上のデスミンは相互作用し、T管のZ線への架橋を支持している可能性が高いと考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの成果を踏まえ、T管上のδ-サルコグリカン（δSG）とZ線上のデスミンを架橋する分子群を、１．ジストロフィン結合タンパク質（DAPs）、２．DAPs以外のタンパク質、に分けて以下のように行う。
１．ジストロフィン結合タンパク質（DAPs）
左心室筋からZ線結合タンパク質分画を調整し、全てのDAPsに対してイムノブロットを行う。T管とZ線を架橋するDAPsは、正常ではZ線タンパク質分画に検出されるが、TO-2では欠損あるいは激減することが予想される。そして、候補DAPのcDNAをpCITE発現ベクターに組み込み、35S標識タンパク質として合成する。一方、δSG及びデスミンのcDNAをpET発現ベクターに組み込み、融合タンパク質として発現させ、ビーズ上に固相化する。標識及び融合タンパク質をインキュベートの後に遠心し、沈降物の放射能活性の有無で結合を検証する。
２．DAPs以外のタンパク質
標的分子は、MatchMaker Gal4 Two-Hybrid System 3（Takara）を用い、酵母のtwo-hybrid系を用いて探索する。δSGは一回膜貫通型タンパク質であるので、Z線との架橋に関わる分子とはその細胞内ドメインで結合する筈である。そこで、δSGの細胞内ドメインに対応するcDNAをpGBK9発現ベクターに組み込み、pGADT7ベクターで作成した心筋発現ライブラリーと共に酵母AH109株に形質導入する。酵母の中でδSGの細胞内ドメインとその結合タンパク質が同時に発現した場合、３つのレポーター遺伝子（ADE2、HIS3、LacZ）が活性化されることで、寒天培地上に青いコロニーを形成する。このコロニーからpGADT7ベクターに組み込まれたプラスミドを抽出することで、δSG結合タンパク質をコードするcDNAを単離する。
以上の結果を総合し、T管上のδSGとZ線上のデスミンを架橋する分子群の全容を解明する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初の予定より実験を効率的に遂行することにより、経費を削減することができたため。
次年度には、研究の幅を一層広げるために、繰り越した経費を有効活用する。
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