2013 Fiscal Year Research-status Report
核磁気共鳴(NMR)技術を利用した非侵襲的膵β細胞定量法の開発
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25670258
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
稲垣 暢也 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30241954)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 哲也 京都大学, 情報学研究科, 教授 (00209561)
豊田 健太郎 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (00447971)
木村 寛之 京都大学, 学内共同利用施設等, 助教 (50437240)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | イメージング / 糖尿病学 |
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| Research Abstract |
本研究では、核磁気共鳴(Nuclear magnetic resonance,NMR)の技術を用いて、非侵襲的に膵β細胞量を検知するために、①膵β細胞特異的なプローブを設計・合成し、②超高磁場MR装技術を用いて核磁気共鳴(MR)スペクトロスコピー(Magnetic resonance spectroscopy,MRS)を行い、③糖尿病モデル動物で検証する。
平成25年度は、MRS 解析用プローブの合成し、受容体親和性などの基礎評価とINS1細胞を用いたin vitroの結合評価を行った。具体的には、Exendin(9-39)の12位にフッ素分子を6分子リンカーを用いて結合させたプローブを合成し、膵β細胞腫瘍株INS-1細胞に暴露し、洗浄後にMRS解析を行った。しかしながら予想される0ppmに19F由来のシグナルが得られなかった。細胞数を増やし解析時間を延長しても同様の結果であった。そこで、GLP-1 受容体への親和性の低下を結合実験で行ったところ、IC50=1.15(μM)と従来のExendin(9-39)に比して10倍以上結合能が低下していた。そこで、基本骨格をExendin(9-39)からExendin4に変更して新たなプローブを合成した。合成後、まずGLP-1受容体結合能を評価したところ、IC50=0.09(μM)と強い結合能が維持されていた。次に、INS-1細胞での同様の実験を行い、2、14、28時間のMRS解析した結果、前検討と同様0ppm周辺に強いシグナルピークを認めた。
しかしながら、19F標識Exedin4溶液と、28時間解析検体において、12ppmに小さなブロードのピークを検出しており、その由来が不明であったため原因探索を開始した。
最終的に、小ピークがプローブ由来、0ppmの大シグナルがペプチド合成で混入していたTFAによるシグナルと判明した。28時間解析でのプローブ由来シグナルはわずかであるため、実験系の改良が必要と判断した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度の検討において、前検討で得られていた0ppm周辺のシグナルが混入物によるピークと判明したことは予想外の結果であった。本研究の根幹に関わる問題で有、その原因探索に時間を要したことは事実であるが、結果として12ppm付近のピークがプローブ由来と判明し、かつ、わずかながら28時間解析で検知できていることも判明した。以上の結果から、今後シグナル増強させる実験系が構築できれば、予定通りの解析を進められると判断した。すでに、ヒトGLP-1受容体発現ベクターの構築を開始しており、本研究は、当初予定通りに進められている状況であるため、区分を「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
【1】MRS 解析用in vitro 実験系の構築：結合能が維持されている19F標識Exendin4プローブを用いても、100万個のINS-1細胞を用いた28時間のMRS解析によるプローブ由来シグナルはごくわずかであった。従って、当初予定の通り、今後の定量性評価や19F-MRI による画像化検討を行うために、安定して高MRS シグナルが得られる実験系を構築する。具体的には、①. ヒトGLP-1 受容体(hGLP-1R)発現ベクターを作製、②. HEK293 細胞に①のベクターを導入してhGLP-1R安定発現株を作製する。
【2】19F 標識Exendin4プローブを用いたin vitro解析：作製したhGLP-1R安定発現細胞株を用いて19F-MRS 解析を行う。19F-MRS は超高磁場動物用NMR機器（BRUKER Biospec 70/20 USR）を用いて行う。また、この19F-MRS 解析の際には非標識Exendinを用いる阻害実験も並行して行い、得られるMRS シグナルが19F 標識プローブのhGLP-1Rへの結合による特異的シグナルであることを同時に検証する。
【3】糖尿病モデル動物を用いた評価：hGLP-1R安定発現HEK293 細胞を免疫不全マウスに移植し、同超高磁場NRM/MRI 機器を用いて、腫瘍部のMRS 解析とMRI 画像化検討行う。同時に解析条件の最適化を行う。この際、同時にT1, T2 強調画像撮像も施行し、腫瘍だけでなく膵臓において膵β細胞のシグナルが得られるかどうか検証する。次に、ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスや膵島定量モデルを作製し、MRSシグナルと膵島量が相関するかどうか検証する。最後に、自然発症糖尿病モデルを用いて、MRS解析と膵島量の経時的な変化を解析し、本プローブの有用性を検討する。
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[Journal Article] SYR-472, a novel once-weekly dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitor, in type 2 diabetes mellitus: a phase 2, randomised, double-blind, placebo-controlled trial.2014
Author(s)
Inagaki N, Onouchi H, Sano H, Funao N, Kuroda S, Kaku K.
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Journal Title
Lancet Diabetes Endocrinol.
Volume: 2
Pages: 125,132
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Reduction of reactive oxygen species ameliorates metabolism-secretion coupling in islets of diabetic GK rats by suppressing lactate overproduction.2013
Author(s)
Sasaki M, Fujimoto S, Sato Y, Nishi Y, Mukai E, Yamano G, Sato H, Tahara Y, Ogura K, Nagashima K, Inagaki N.
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Journal Title
Diabetes
Volume: 62
Pages: 1996,2003
DOI
Peer Reviewed
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