2014 Fiscal Year Research-status Report

被虐待児の脳におけるDNAメチル化とその神経発達への影響に関する検討

Research Project

Project/Area Number	25670340
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	小湊慶彦群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30205512)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中島たみ子群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (40008561) 佐野利恵群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (70455955)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	虐待
Outline of Annual Research Achievements	平成26年度は、虐待死亡例の解剖時に保存された脳から、大脳皮質、海馬、扁桃体、小脳等についてパラフィン包埋切片を作製した。そこからZEISS社製PALMレーザーマイクロダイセクションシステムを利用して、神経細胞層を特異的に切り出し、そこからQIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN社)を用いてDNAを抽出し、そのDNAにEpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN社)を用いてバイサルファイト処理を施し、プロモーター1Fを標的にPCRを行い、PCR産物をクローニングベクターpUC118に組み込み、各クローンの塩基配列をBigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kitを用いて調べることでメチル化の検索を行った。1回目のPCRに用いたプライマーは5’-GTGGTGGGGGATTTG-3’、5’-ACCTAATCTCTCTAAAAC-3’であり、PCR条件は、40cycles of 98 degree for 10sec, 53.8 degree for 30sec, 72 degree for 2min等であった。2回目のPCRに用いたプライマーは5’- TTTTTGAAGTTTTTTTAGAGGG-3’、5’- AATTTCTCCAATTTCTTTTCTC-3’であり、PCR条件は、40cycles of 98 degree for 10sec, 56.1 degree for 30sec, 72 degree for 2min等であった。結果は、海馬で24アリルを調べたところ、左海馬では12アリル中の5アリル、右海馬では12アリル中の7アリルにメチル化が認められた。ほとんどのメチル化部位は転写因子NGFI-Aの認識配列に位置し、2箇所以上のメチル化を有するアリルが5アリルあった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 脳から作製されたパラフィン包埋切片からQIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN社)を用いてDNA抽出を行い、良好なDNA抽出を実現するために、試薬量、組織面積やプレパラート数の条件検討を行い、条件設定を行えた。次に、EpiTect Bisulfite Kit (QIAGEN社)を用いてDNAのバイサルファイト処理を行い、良好なバイサルファイト変換を実現するために、試薬量、DNA量の条件検討を行い、条件設定を行えた。一方、細胞の種類によってDNAメチル化が変化することから、細胞収集の選択性を高め、異種類の細胞を排除した形でDNA抽出を実現するために、ZEISS社製PALMレーザーマイクロダイセクションシステムを利用した細胞収集とDNA抽出を実行した。以上から、メチル化検出のための一連の作業工程を確立し、虐待脳の試料を用いて、メチル化の検索を行った。
Strategy for Future Research Activity	平成27年度は、コントロールの脳から作製されたパラフィン包埋切片からDNA抽出を行い、メチル化の程度を調べる計画である。前頭回、海馬、扁桃体、小脳等のメチル化を調べる予定である。