2013 Fiscal Year Research-status Report
消化管間質腫瘍の悪性度を規定する長鎖non-coding RNAの探索
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25670371
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
篠村 恭久 札幌医科大学, 医学部, 教授 (90162619)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | GIST / ncRNA / HOTAIR / ChIP-seq |
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| Research Abstract |
消化管間質腫瘍 (gastrointestinal stromal tumor, GIST) 治療の第一選択は原則として外科手術である。腫瘍径5cm以上のGISTは特に転移のリスクが高いため外科的切除が推奨されるが、2～5cmのGISTを全て切除すべきかどうかは未だ議論のあるところである。GISTの悪性度や予後を規定する遺伝子は不明であり、リスク予測に有用な分子マーカーの発見が待ち望まれている。これまでに我々は、GISTにおけるエピジェネティクス異常の解析から、ゲノムワイドなDNA低メチル化が悪性度と強く相関することを見いだした。さらにmicroRNA-196aと長鎖non-coding RNA（ncRNA）であるHOTAIRの過剰発現がGISTの悪性度と強く相関することを明らかにした。細胞株を用いた詳細な検討の結果、これらの過剰発現にはヒストン修飾が関与すること、そしてHOTAIRの阻害がGIST細胞の浸潤能を抑制することを明らかにしてきた。
今回、我々は手術切除あるいは内視鏡下に生検された新鮮GIST検体をChIP-seq用、RNA-seq用、DNA抽出用に3分割して抗ヒストン抗体を用いて、クロマチン免疫沈降法（ChIP）を施行。ChIP-DNAの質（シグナル－ノイズ比）をqPCRにて確認後、ChIP-seqライブラリを作成した。また本研究のワークフローが確立した後は、複数の検体（低リスク群GIST5例、高リスク群GIST5例）に対してChIP-seq 実験およびRNA-seq実験を行い、主にH3K4me3に関するデータを収集した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
悪性GISTで特異的に活性化あるいは不活性化されている長鎖ncRNAの候補がいくつか同定されつつある。またES細胞におけるncRNAのデータやNIH Roadmap Epigenomics Projectで公開されているChIP-seq、RNA-seq 等の既存のデータを最大限活用し、統合的な解析も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに同定し絞り込まれた長鎖ncRNAのリストに対し、30～50例の臨床検体（DNAとRNA)を用いて、TaqMan-qPCRによる発現量の検討やpyrosequencingによるプロモーター部のDNAメチル化の定量等を施行する。突然変異や融合遺伝子の有無に関しては、長鎖ncRNA候補領域をPCR､増幅しIon PGMシークエンサーを用いて多サンプルの多領域を同時にスクリーニングする。
また同定された長鎖ncRNAの異常に関して、より多数の検体（100例）を用いて確認を行う。臨床病理学的な特徴との関連、予後との関連、他の既知の異常（KIT3やPDGFR変異、ゲノムワイドな低メチル化など）との関連に関してより詳細な検討を行い、本研究の命題に対する答えを明らかにする。
札幌医科大学では、次世代シークエンサーSOLiD4、半導体チップシークエンサー(Ion PGMシークエンサー)。連携研究者の研究室にはバイオインフォマティクス解析に必要な機器およびスタッフがおり、シークエンスデータの解析、公的データベースからダウンロードしたデータとの統合解析などが可能である。また申請者の研究室ではパイロシークエンサー、リアルタイムPCR装置を設置しているため、RNA発現、DNAメチル化およびヒストン修飾解析も行う予定。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
GIST症例のサンプル収集が当初の予定よりもやや遅れており、それらが揃うまで解析するのを待っていた。その結果、予定していた一部の試薬購入を先送りすることになってしまったため。
内視鏡的あるいは外科手術で切除されたGIST症例のサンプル収集が無事終了したため、それらからDNAやncRNAを抽出するための試薬、また各種PCRのための試薬も合わせて購入する。
更にGIST検体を用いたChIP-seq法およびRNA-seq法を確立し、安定したワークフローの構築を目指す。次に低リスク群GISTおよび高リスク群GISTの臨床検体を用いて、ゲノムワイドなヒストン修飾およびRNA発現を解析し、その分布様式を網羅的に検討することで、GISTにおいて発現している長鎖ncRNAを同定する。
臨床病理像と併せて検討し、悪性度に応じて発現変動の見られる長鎖ncRNAを同定する。さらにGISTにおいてそれらncRNAにジェネティック、エピジェネティックな異常が認められないか、多数の臨床検体を用いて検証する。
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