2013 Fiscal Year Research-status Report
アレイ技術革新による感染症と癌の克服への新たな挑戦：hTEC10の開発
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25670463
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
村口 篤 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (20174287)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 感染症 / 癌治療 / リンパ球チップ / 抗体 / T Cell Receptor |
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| Research Abstract |
1）抗原特異的T細胞の単一細胞の迅速検出法の確立を目的として、以下の研究成果を得た。
①抗原であるMHC/ペプチド五量体（MHC/p）をT細胞へ結合させ、セルソータを用いて単一細胞を分離した。②抗原でリンパ球を刺激しサイトカインの産生を指標にセルソータを用いて単一細胞を分離した。③ ①および②で得られた単一細胞から、5’-RACE法を用いてTCRα/TCRβ遺伝子を増幅し、レトロウイルスを用いてTCR欠損のT細胞（TG40）にTCRα/TCRβ遺伝子を導入し、ペプチドを発現させた抗原提示細胞あるいはMHC/ペプチドで刺激し、活性化マーカーの発現をFACSで測定することでTCRの機能を解析した。
2）ISAAC法の応用：T-ISAACを確立することを目的として、以下の研究成果を得た。
①MHC クラスI分子を発現したミセルを作製し、チップ内で刺激する方法は、均一サイズのミセルの作製に困難を伴った。不均一な状態で、チップ内の抗原特異的T細胞を刺激したが、コントロールに比較して特異的なスポットは得られなかった。②次に、抗原特異的T 細胞自身のMHC クラスI分子に抗原ペプチドを負荷し、チップ内でペプチドで刺激し、サイトカイン産生を検出した結果、抗原特異的、濃度特異的にスポットが得られた。さらに、チップ内の細胞を回収し、5’-RACE法を用いてTCRα/TCRβ遺伝子を解析したところ、単一のTCR遺伝子が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1）抗原特異的T細胞の単一細胞の迅速検出法の確立
①抗原であるMHC/ペプチド五量体（MHC/p）をT細胞へ結合させ、セルソータを用いて単一細胞を分離することができた。②抗原でリンパ球を刺激しサイトカインの産生を指標にセルソータを用いて単一細胞を分離することができた。③ ①および②で得られた単一細胞から、5’-RACE法を用いてTCRα/TCRβ遺伝子を増幅し、TCR欠損のT細胞（TG40）を用いて、TCRの機能を解析することができた。以上により、抗原特異的T細胞の単一細胞を10日間で検出できる画期的システムを作ることができ、研究は順調に進んだと考えられる。
2）ISAAC法の応用：T-ISAACの確立
①MHC クラスI分子を発現したミセルを作製し、チップ内で刺激する方法は、均一サイズのミセルの作製に困難を伴った。不均一な状態で、チップ内の抗原特異的T細胞を刺激したが、コントロールに比較して特異的なスポットは得られなかった。ミセル自身が非特異的に細胞を刺激する可能性が示唆された。②次に、抗原特異的T 細胞自身のMHC クラスI分子に抗原ペプチドを負荷し、チップ内でペプチドで刺激し、サイトカイン産生を検出した結果、抗原特異的、濃度特異的にスポットが見られた。さらに、チップ内のT細胞を回収し、5’-RACE法を用いてTCRα/TCRβ遺伝子を解析したところ、OVA-TCRのTCR遺伝子が得られた。しかしながら、TCR遺伝子の増幅率が極端に低く、問題点が明かになった。原因として、ペプチド刺激によるT細胞の活性化が不十分であることが考えられた。
以上により、研究は概ね順調に進んでいると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1）サイトカイン産生を細胞チップを用いて検出し単一細胞を分離する方法（T-ISAAC）の確立
これまでに直径10μm のウェルに1 個ずつ細胞を導入し、チップ上で細胞をPMA/ionomycinで刺激することにより、23万個のT 細胞のサイトカイン産生を単一細胞レベルで検出できる方法を確立している。T 細胞は抗原ペプチドを用いてin vitro で刺激するとサイトカインを分泌するが、抗原ペプチドを取り除くと急速にサイトカイン産生が無くなる。したがって、細胞チップ上で、T 細胞を抗原ペプチドにて刺激する系を確立する必要がある。
そのために、CD8+ T 細胞自身のMHC クラスI分子に抗原ペプチドを負荷し、チップ内で刺激し、サイトカイン産生細胞を回収し、TCR遺伝子を増幅し、配列と機能を解析する方法を解析する。これらの効果を検証するために、H-2Kb MHC class I 分子に結合した卵白アルブミン（OVA）ペプチドを認識するTCR を発現したOT-1 TCR トランスジェニックマウス、およびヒト健常人のEBV潜在的感染者の末梢血細胞を用いる。また、OVAおよびEBVペプチド添加によるT細胞のシスアクティベーションのメカニズムおよび免疫生物学的意義についての研究を進める。
【2】癌特異的TCRの迅速作製と治療への応用
金沢大学（金子研究室）では、肝臓がんを中心にペプチドワクチン療法を進めている。金沢大学と共同し、効果が確認された患者よりリンパ球を採取し、ペプチドワクチン特異的T 細胞をT-ISSAC法を用いて検出し、TCR を取得し、抗原特異性およびCTL活性を解析するシステムを構築する。金沢大学（金子研究室）にて、がんの治療に応用すべく研究を推進していく。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
細胞チップを用いた解析が予定以上に順調に進んだため、チップや試薬の購入が予定より少なくすみ、研究費の繰り越しが生じた。
患者やボランティア等、ヒトのサンプルを用いてシステムの検証を行うため、チップや試薬を予定よりも多めに購入する。
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