アレイ技術革新による感染症と癌の克服への新たな挑戦：hTEC10の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25670463
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 村口 篤 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (20174287)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 感染症 / 癌治療 / リンパ球チップ / 抗体 / T cell receptor

Outline of Annual Research Achievements

1)単一細胞から取得したTCRの機能解析法を確立することを目的として、ヒトのEBV特異的TCR遺伝子を相同組換え法により発現ベクターに組込み、TCR欠損CD3陽性CD8陽性T細胞株(変異TG40)にEBV特異的TCR/CD3分子を細胞表面に発現させた。次に、TCR導入変異TG40細胞を、EBVペプチドを発現させた抗原提示細胞あるいはMHC/ペプチドテトラマーで刺激し、活性化マーカーCD69の発現をFACSで測定、同時にIL-2産生能をELISAで測定した。その結果、EBVペプチド特異的にEBV特異的TCRを発現させたTG40変異細胞にCD69が発現し、またIL-2産生が見られた。このように、抗原特異的T細胞の検出からTCR遺伝子の取得・機能検証までを全体として10日間以内で行える画期的なhTEC10システムを確立できた。
2）金沢大学(金子研究室)との共同により、hTEC10システムを用いて、肝細胞がん患者の末梢血T細胞からα-フェトプロテイン（AFP）特異的TCRの取得を行った。ペプチドワクチン療法で効果が認められた肝細胞がん患者の末梢血T細胞を得て、AFPペプチド・MHCテトラマーに反応するT細胞からTCR遺伝子を単離し、上記1)の方法で機能を解析した。その結果、数個のペプチドワクチン特異的TCRを獲得できた。次に、このTCRを末梢血T細胞に遺伝子導入してTCRを発現させ、AFPペプチドを負荷した抗原提示細胞を標的として細胞傷害活性（キラー活性）を測定したところ、ペプチド特異的にキラー活性を認めた。このことは、hTEC10システムにより、がん患者からキラー活性を持つTCRを極めて短期間に取得できることを実証したものであり、がんのTCR遺伝子治療への道を開くものとして注目すべき成果である。

Research Products

• [Journal Article] Identification of broadly conserved cross-species protective Leishmania antigen and its responding CD4+ T cells. (2015)
  • Author(s): Mou Z, Li J, Boussoffara T, Kishi H, Hamana H, Ezzati P, Hu C, Yi W, Liu D, Khadem F, Okwor I, Jia P, Shitaoka K, Wang S, Ndao M, Petersen C, Chen J, Rafati S, Louzir H, Muraguchi A, Wilkins JA, Uzonna JE.
  • Journal Title: Sci Transl Med. Volume: 7 Pages: 310ra167
  • DOI: 10.1126/scitranslmed.aac5477.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Immunological features of T cells induced by human telomerase reverse transcriptase-derived peptides in patients with hepatocellular carcinoma. (2015)
  • Author(s): Mizukoshi E, Nakagawa H, Kitahara M, Yamashita T, Arai K, Sunagozaka H, Fushimi K, Kobayashi E, Kishi H, Muraguchi A, Kaneko S.
  • Journal Title: Cancer Lett. Volume: 364 Pages: 98-105
  • DOI: 10.1016/j.canlet.2015.04.031.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. (2015)
  • Author(s): Takeda H, Ogasawara T, Ozawa T, Muraguchi A, Jih PJ, Morishita R, Uchigashima M, Watanabe M, Fujimoto T, Iwasaki T, Endo Y, Sawasaki T.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 5 Pages: 11333
  • DOI: 10.1038/srep11333.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Human Anti-M2 Antibody Mediates Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) and Cytokine Secretion by Resting and Cytokine-Preactivated Natural Killer (NK) Cells. (2015)
  • Author(s): Simhadri VR, Dimitrova M, Mariano JL, Zenarruzabeitia O, Zhong W, Ozawa T, Muraguchi A, Kishi H, Eichelberger MC, Borrego F.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 10 Pages: e0124677
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0124677.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Monoclonal antibody against citrullinated peptides obtained from rheumatoid arthritis patients reacts with numerous citrullinated microbial and food proteins. (2015)
  • Author(s): Tsuda R, Ozawa T, Kobayashi E, Hamana H, Taki H, Tobe K, Sugiyama E, Iwamoto M, Imura J, Kishi H, Muraguchi A.
  • Journal Title: Arthritis Rheumatol. Volume: 67 Pages: 2020-2031
  • DOI: 10.1002/art.39161.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Comprehensive T-Cell Receptor Repertoire Analysis Using Deep Sequencing and Single Cell Cloning Reveals Extreme Oligoclonality of Ex Vivo Expanded Cytomegalovirus-Reactive Cytotoxic T-Cells. (2015)
  • Author(s): Miyama T, Kawase T, Kitaura K, Chishaki R, Shibata M, Oshima K, Hamana H, Kishi H, Kuzushima K, Saji H, Suzuki R, Ichinohe T.
  • Organizer: The 57th ASH Annual Meeting and Exposition
  • Place of Presentation: Orlando（米国）
  • Year and Date: 2015-12-05 – 2015-12-08
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ISAAC法を用いた関節リウマチ患者由来自己抗体の単離とその自己抗体が認識する新しい自己抗原の同定． (2015)
  • Author(s): 小澤龍彦，津田玲奈，浜名 洋，多喜博文，戸邉一之，杉山英二，岩本雅弘，井村穣二，岸 裕幸，村口 篤．
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] コムギ無細胞系を用いた膜タンパク質間トランス相互作用解析技術． (2015)
  • Author(s): 栄谷紘一，竹田浩之，小澤龍彦，村口 篤，澤崎達也．
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 抗膜タンパク質ウサギ高親和性モノクローナル抗体のエピトープ配列を由来とする新規アフィニティタグの開発． (2015)
  • Author(s): 矢野智也，竹田浩之，小澤龍彦，村口 篤，澤崎達也．
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ISAAC法による日本脳炎ワクチン被接種者末梢血単核球からのヒト抗ウエストナイルウイルス中和モノクローナル抗体の樹立． (2015)
  • Author(s): 正木秀幸，小澤龍彦，高崎智彦，青山幾子，弓指孝博，小西英二，岸 裕幸，村口 篤．
  • Organizer: 第63回日本ウイルス学会学術集会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2015-11-22 – 2015-11-24
• [Presentation] Assessment of T cell receptor function. (2015)
  • Author(s): Kishi H, Hamana H, Shitaoka K, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Development of an NFAT-luciferase reporter system for screening of antigen-specific TCRs using non-T cells. (2015)
  • Author(s): Hamana H, Kishi H, Shitaoka K, Piao X, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Identification of tumor-specific T cell receptors from primary tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) obtained from B16F10 melanoma-bearing mice. (2015)
  • Author(s): Shitaoka K, Kishi H, Hamana H, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Identification of T-cell receptors of the CD8+ T cells in response to HLA-A24 restricted epitopes from hepatitis B virus. (2015)
  • Author(s): Tamai T, Kishi H, Shitaoka K, Hamana H, Ozawa T, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Reactivity of a monoclonal ACPA obtained from RA patient with numerous citrullinated antigens. (2015)
  • Author(s): Ozawa T, Tsuda R, Hamana H, Taki H, Kishi H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] TRAIL receptor-1 IgM antibodies strongly induced apoptosis in cancer cells. (2015)
  • Author(s): Piao X, Ozawa T, Kishi H, Shitaoka K, Hamana H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Isolation of monoclonal anti-TRIM21/Ro52 autoantibodies from collagen disease-patients with interstitial lung disease and their reactivity to the peptide library. (2015)
  • Author(s): Obi M, Ozawa T, Taki H, Kishi H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Establishment of West Nile virus-neutralizing human monoclonal antibodies derived from the individuals vaccinated with inactivated Japanese encephalitis virus by ISAAC technology. (2015)
  • Author(s): Masaki H, Ozawa T, Takasaki T, Kishi H, Muraguchi A.
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18 – 2015-11-20
• [Presentation] Single Cell Analysis of Antigen Receptors of Lymphocytes for Tumor Immunology and Immunotherapy. (2015)
  • Author(s): Kishi H.
  • Organizer: The Korean Association of Immunologists 2015 Fall Conference
  • Place of Presentation: Seoul（韓国）
  • Year and Date: 2015-11-12 – 2015-11-13
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Comprehensive analysis of CMV-specific T-cell repertoire by deep sequencing and single cell cloning． (2015)
  • Author(s): 美山貴彦，川瀬孝和，北浦一孝，樗木 錬，柴田真志，大島久美，浜名 洋，岸 裕幸，葛島清隆，佐治博夫，鈴木隆二，一戸辰夫．
  • Organizer: 第77回日本血液学会学術集会
  • Place of Presentation: 石川県立音楽堂（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-10-16 – 2015-10-18
• [Presentation] プライマリー腫瘍浸潤リンパ球を用いた腫瘍特異的T細胞受容体同定の試み． (2015)
  • Author(s): 岸 裕幸，村口 篤．
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
• [Presentation] 悪性リンパ腫における腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球の解析． (2015)
  • Author(s): 村橋睦了，岸 裕幸，松本太一，原 周司，村口 篤，田村和夫，谷憲三朗．
  • Organizer: 第74回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
• [Presentation] 悪性リンパ腫における腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球の解析． (2015)
  • Author(s): 岸 裕幸，村橋睦了，浜名 洋，松本太一，原 周司，猪狩洋介，石塚賢治，高松 泰，田村和夫，谷憲三朗，村口 篤．
  • Organizer: 第7回血液疾患免疫療法研究会学術集会
  • Place of Presentation: 東京大学伊藤謝恩ホール（東京都文京区）
  • Year and Date: 2015-09-26
• [Presentation] 悪性リンパ腫における腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球の解析． (2015)
  • Author(s): 村橋睦了，松本太一，浜名 洋，勝屋弘雄，猪狩洋介，石塚賢治，原 周司，岸 裕幸，高松 泰，田村和夫．
  • Organizer: 第13回日本臨床腫瘍学会学術集会
  • Place of Presentation: ロイトン札幌（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-07-16 – 2015-07-18
• [Presentation] Distinct pattern of the binding of human monoclonal anti-cyclic citrullinated peptide antibody to joint synovium in between osteoarthritis and rheumatoid arthritis. (2015)
  • Author(s): Iwamoto M, Honne K, Hanai S, Sekiya H, Ozawa T, Kishi H, Muraguchi A, Minota S.
  • Organizer: 2015 Henry Kunkel Meeting
  • Place of Presentation: Annecy（フランス）
  • Year and Date: 2015-04-14 – 2015-04-16
  • Int'l Joint Research