2014 Fiscal Year Research-status Report
診断困難な感染症のための次世代シーケンサを用いた新規診断法の開発
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25670468
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
後藤 恭宏 宮崎大学, 医学部, 助教 (20558358)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 病原微生物 / 感染症診断 / 次世代シーケンサ / 細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
臨床検体、例えば、血液検体からDNA試料を調整しても、大量のヒトDNAの混入（全DNAの99.9%以上）は避けられず、大型の次世代シーケンサを用いても病原体由来配列の取得は容易ではない。そこで、細菌DNAを選択的に精製できる試料調整が必要である。本年度の研究では、ヒトと細菌の間でのメチル化DNAパターンの違いを利用するために、メチル化認識性制限酵素で処理した細菌由来DNAを濃縮させた試料調整法を検討した。まず、DNAが可能な限り大きな断片で精製できるよう注意を払いながら、DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen社）を用いて精製した。敗血症を想定して、サルモネラと大腸菌、セラチア、緑膿菌、黄色ブドウ球菌を用いた。それらにマウスDNAを加えた計6つのDNAサンプルとメチル化認識性制限酵素を、それぞれ37度で6時間反応させた後、熱処理（65度で20分間）し反応を停止させた。実験にはDNAの認識配列が異なるメチル化認識性制限酵素MspJIやFspEI, LpnPI、McrBCを用いた。DNAバンドパターンの違いはアガロース電気泳動により確認した。その結果、McrBCはマウスDNAのみを断片化し、細菌5菌種由来のDNAを断片化しなかった。また、MspJIやFspEI、LpnPIは、マウスDNAだけでなく幾つかの細菌由来DNAを断片化することが確認された。このことから、臨床検体から細菌DNAを濃縮するためには、メチル化認識性制限酵素McrBCが有効である可能性が示された。また、次世代シーケンサMiSeqによる配列解析をもとに原因菌を同定するために、迅速化と簡便化を計った解析パイプラインの構築についても検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒトDNAの除去を想定し、DNA検体をメチル化DNA認識性制限酵素で処理することによって、それに含まれる細菌DNAを濃縮した試料の調製法に目処が立ったと考えられる。これに次世代シーケンサを組み合わせることで、病原体に由来する配列情報の取得が可能であると考えられる。また、次世代シーケンサMiSeqによる配列解析をもとに原因菌を同定するための解析パイプラインの構築についても実施した。以上から、おおむね、計画どおりに実施することができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策は、当初の計画に沿ったものである。メチル化DNA認識性制限酵素を用いたヒトDNA除去の検討により、病原体に由来する配列情報の取得を可能にした。これまでに検討した細菌DNA濃縮試料の調製法をもとに、一番効率の良い手法を用いて、敗血症ラットのモデルや臨床検体を用いた細菌DNA濃縮調整法の有効性評価を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由として、今年度はDNA検体をメチル化認識性制限酵素で処理することによって細菌DNAを濃縮させた試料調製法の検討を実施したが、それを臨床検体を想定したDNA検体での試料調整および次世代シーケンスの実施を次年度に実施することが挙げられる。また、成果報告のための投稿論文が準備の段階にあり、投稿に至っていないことが挙げられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
臨床検体を想定したDNA検体での試料調整および次世代シーケンスの実施にかかる試薬を次年度に使用する。また、これらの成果を今年度までの成果と併せ、論文を作成および投稿する。それらに係る費用の使用を計画している。
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