巨大ジストロフィン遺伝子に内在する非ジストロフィン遺伝子のクローニング

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25670480
• Research Institution: Kobe Gakuin University
• Principal Investigator: 松尾 雅文 神戸学院大学, 総合リハビリテーション学部, 教授 (10157266)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: ジストロフィン遺伝子 / mRNA / 転写産物

Outline of Annual Research Achievements

非ジストロフィン遺伝子の全長cDNAのクローニング
これまでのDMD症例の詳細な解析結果と多数のジストロフィンmRNA解析結果からジストロフィン遺伝子の中央部に独自のプロモーターと終止コドンを有するmRNAの存在が強く示唆されている。その示唆に基づき新しいmRNAの断片配列を入手し、その断片配列を手懸りとして転写産物の全長を明らかにした。明らかにした全長cDNAは、一部ジストロフィンの配列と重なるが、3’末端領域の配列が全く異なり非ジストロフィン遺伝子産物と確認された。さらに、ヒトの各組織由来のRNAを用いて、RT-PCR法でその発現を検討した。その結果、RT-PCR産物が組織特異的に得られ、このｍRNAが組織特異的に発現していることが判明した。
新規mRNAにコードされたタンパク解析
明らかにした塩基配列をもとに新規cDNAにコードされたタンパクのアミノ酸配列を明らかにした。そして、このアミノ酸の配列中のジストロフィンとは異なる新規配列部位を特異的に認識する抗体の作製をはかった。新規配列中の抗原性の高い配列についてペプチドを合成し、それを免疫源としてウサギに投与したところ、特異的抗体と考えられる抗体の作製に成功した。
そして、得られた抗体を用いてヒト各組織を免疫染色した。ヒト各種の組織でひろくこの抗体に反応するタンパクが発現していることが確認された。また、尿のタンパクをこの抗体を用いたウェスターンブロット法により解析したところ、この抗体に反応するタンパクが尿中に存在することが明らかになった。そこで、この抗体に反応するタンパクについて、尿を試料としてさらなる解析を行っている。