モルフォリーノの特異的遺伝子発現抑制を介した先天性大脳白質形成不全症の治療研究

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25670485
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター
• Principal Investigator: 井上 健 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所疾病研究第二部, 室長 (30392418)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: トランスレーショナルリサーチ / 脳神経疾患 / アンチセンス / 発現制御 / 治療法開発

Research Abstract

Pelizaeus-Merzbacher病（PMD）は、中枢神経系の髄鞘形成不全を特徴とする小児神経難病である。最も頻度の高い変異であるPLP1重複は、過剰遺伝子発現がその病態と考えられるが、現在有効な治療法はない。そこで、本研究ではPLP1重複変異に対する治療法を開発するために、合成核酸様物質モルフォリーノによるPLP1遺伝子の特異的発現抑制を用いたアンチセンス療法の開発を行う。モルフォリーノは、効果の持続性、効率、安全性から最も臨床応用の可能性の高いアンチセンスオリゴである。対象はPLP1重複のモデル動物であるPLP1トランスジェニックマウスで、脳実質内、脳室内、血管内、鼻腔内など様々な投与法について検討し、最も効果的な治療法を探る。この研究成果は、ゲノム病一般の治療法開発に応用可能な技術として期待できる。
本年度は、まず培養細胞系でのVivoMの遺伝子抑制効率の検証を行った。標的遺伝子に対する最適なモルフォリーノの配列の選定は、PLP1遺伝子の翻訳開始部位を標的とし、GeneTools社の専用ソフトを用いて行った。十分な5’UTRを含むPLP1cDNAをGFP上流に組み込んだ発現プラスミドを構築し、これをHeLa細胞に一過性に導入した後、VivoMを投与し、遺伝子抑制効果を蛍光顕微鏡およびウェスタンブロットにより観察し、PLP1蛋白質の発現抑制効果を検証した。現在、生後１～３日の野生型マウスの脳室内および脳実質内への投与による組織毒性や遺伝子発現効果の検証を実施している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初計画においては、1. 培養細胞系でのVivoMの遺伝子抑制効率の検証として A. 標的遺伝子に対する最適なモルフォリーノの配列の選定、 B. 培養細胞を用いた遺伝子抑制効果の検証。2. 野生型マウスでのVivoMの各種投与法による発現抑制効率の検証とプロトコールの確立として、生後数日の野生型マウスの脳室内あるいは脳実質内へのモルフォリーノ投与技術及び評価法の確立を実施し、ほぼ計画通りに実施することが出来た。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度は、脳内への直接投与の系が確立した際には、臨床応用を見据えた投与方法の確立として、非侵襲的投与方法の開発と効果の検証として、 血管内投与および鼻腔内投与などについて、検討を行う予定である。同時に、本治療法の標的となるPLP1重複変異のモデルマウスであるPLP1トランスジェニックマウスに対する治療効果の検証を実施する予定である。まずは、脳室内および脳実質内への投与による治療効果の検証を行う。アウトプットとして、生存率な運動機能の評価、さらに髄鞘化やオリゴデンドロサイトの細胞死などについて、検証を行う。

Research Products

• [Journal Article] Attenuation of endoplasmic reticulum stress in Pelizaeus-Merzbacher disease by an anti-malaria drug, chloroquine. (2014)
  • Author(s): Morimura T, Numata Y, Nakamura S, Hirano E, Gotoh L, Goto Y, Urushitani M, Inoue K
  • Journal Title: Exp Biol Med Volume: 239 Pages: 489-501
  • DOI: 10.1177/1535370213520108
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epidemiological, clinical, and genetic landscapes of hypomyelinating leukodystrophies. (2014)
  • Author(s): Numata Y, Gotoh L, Iwaki A, Kurosawa K, Takanashi JI, Deguchi K, Yamamoto T, Osaka H, Inoue K
  • Journal Title: J Neurol Volume: 261 Pages: 752-758
  • DOI: 10.1007/s00415-014-7263-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Three new PLP1 splicing mutations demonstrate pathogenic and phenotypic diversity of Pelizaeus-Merzbacher disease. (2014)
  • Author(s): Lassuthova P, Zaliova M, Inoue K, Haberlova J, Sixtova K, Sakmaryova I,Paderova K, Mazanec R, Zamecnik J, Siskova D, Garbern J, Seeman P.
  • Journal Title: J Child Neurol Volume: 0 Pages: 0
  • DOI: doi: 10.1177/0883073813492387
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Different patterns of cerebellar abnormality and hypomyelination between POLR3A and POLR3B mutations. (2014)
  • Author(s): Takanashi J, Osaka H, Saitsu H, Sasaki M, Mori H, Shibayama H, Tanaka M, Nomura Y, Terao Y, Inoue K, Matsumoto N, Barkovich J
  • Journal Title: Brain Dev Volume: 0 Pages: 0
  • DOI: doi: 10.1016/j.braindev.2013.03.006
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] GJC2 promoter mutations causing Pelizaeus-Merzbacher-like disease. (2014)
  • Author(s): Gotoh L, Inoue K, Helman G, Mora S, Maski K, Soul JS, Bloom M, Evans SH, Goto Y, Caldovic L, Hobson GM, Vanderver A.
  • Journal Title: Mol Genet Metab. Volume: 111 Pages: 393-8
  • DOI: doi: 10.1016/j.ymgme.2013.12.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Partial PLP1 deletion causing X-linked dominant spastic paraplegia type 2. (2013)
  • Author(s): Matsufuji M, Osaka H, Gotoh L, Shimbo H, Takashima S, Inoue K
  • Journal Title: Pediatric Neurology Volume: 49 Pages: 477-81
  • DOI: doi: 10.1016/j.pediatrneurol.2013.07.012
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 先天性大脳白質形成不全症：ゲノム解析から診断、治療への取り組み (2013)
  • Author(s): 井上 健，岩城明子，黒澤健司，高梨潤一，出口貴美子，山本俊至，小坂 仁
  • Journal Title: 脳と発達 Volume: 45 Pages: 122-126
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Brain N-acetylaspartate is Increased in mouse models of Pelizaeus-Merzbacher disease: implication for human imaging findings. (2013)
  • Author(s): Inoue K, Itoh Y, Saito S, Aoki I, Barkovich J, Takanashi J.
  • Organizer: 62rd Annual meeting of the American Society of Human Genetics
  • Place of Presentation: Boston, USA（Boston Convention & Exhibition Center）
  • Year and Date: 20131022-20131026
• [Presentation] More than ER stress: molecular mechanism for misfolded PLP1 that impacts subcellular dynamics and clinical severity of Pelizaeus-Merzbacher disease. (2013)
  • Author(s): Numata Y, Morimura T, Nakamura S, Hirano E, Kure S, Goto Y, Inoue K.
  • Organizer: 62rd Annual meeting of the American Society of Human Genetics
  • Place of Presentation: Boston, USA（Boston Convention & Exhibition Center）
  • Year and Date: 20131022-20131026
• [Presentation] Preclinical studies for the treatment of Pelizaeus-Merzbacher disease with clinically applicable compounds, curumin and chloroquine. (2013)
  • Author(s): Inoue K, Morimura T, Numata Y, Yu L-H, Gotoh L, Yamamoto R, Inoue N, Antalfy B, Deguchi K, Osaka H, Goto Y.
  • Organizer: 23rd Meeting of the European Neurological Society
  • Place of Presentation: Barcelona, Spain（Fira de Barcelona）
  • Year and Date: 20130608-20130611
• [Presentation] Abnormal neuronal migration with ischaemic brain injuries may cause cognitive dysfunction in extremely preterm infants. (2013)
  • Author(s): Deguchi K, Kubo K, Armstrong D, Nakajima K, Inoue K.
  • Organizer: 23rd Meeting of the European Neurological Society
  • Place of Presentation: Barcelona, Spain（Fira de Barcelona）
  • Year and Date: 20130608-20130611
• [Presentation] 先天性大脳白質形成不全症の脳MRI画像データベース構築への取り組み
  • Author(s): 井上 健、高梨潤一、小坂 仁、佐藤典子
  • Organizer: 第55回日本小児神経学会総会
  • Place of Presentation: 大分（大分オアシスタワーホテル）
• [Presentation] Pelizaeus-Merzbacher病の細胞内分子病態：小胞体ストレスとシャペロンダイナミクス
  • Author(s): 沼田有里佳、呉繁夫、後藤雄一、井上健
  • Organizer: 第55回日本小児神経学会総会
  • Place of Presentation: 大分（大分オアシスタワーホテル）