モルフォリーノの特異的遺伝子発現抑制を介した先天性大脳白質形成不全症の治療研究

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25670485
• Research Institution: National Center of Neurology and Psychiatry
• Principal Investigator: 井上 健 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所疾病研究第二部, 室長 (30392418)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: トランスレーショナルリサーチ / 脳神経疾患 / アンチセンス / 発現制御 / 治療法開発

Outline of Annual Research Achievements

Pelizaeus-Merzbacher病（PMD）は、中枢神経系の髄鞘形成不全を特徴とする小児神経難病である。最も頻度の高い変異であるPLP1重複は、過剰遺伝子発現がその病態と考えられるが、現在有効な治療法はない。そこで、本研究ではPLP1重複変異に対する治療法を開発するために、合成核酸様物質モルフォリーノによるPLP1遺伝子の特異的発現抑制を用いたアンチセンス療法の開発を行う。モルフォリーノは、効果の持続性、効率、安全性から最も臨床応用の可能性の高いアンチセンスオリゴである。対象はPLP1重複のモデル動物であるPLP1トランスジェニックマウスで、脳実質内、脳室内、血管内、鼻腔内など様々な投与法について検討し、最も効果的な治療法を探る。この研究成果は、ゲノム病一般の治療法開発に応用可能な技術として期待できる。
昨年度、培養細胞を用いたin vitroでのモルフォリーノ配列の選定と効果検証を行い、有効な遺伝子発現抑制効果を有するモルフォリーノを作成した。そこで、本年度はこのモルフォリーノを用いて、PLP1とランスジェニックマウスを用いてin vivoでの効果の検証をおこなった。モルフォリーノは、脳など移行性が低い組織への移行性を高めた修飾モルフォリーノ（vivo-morpholino）を使用した。GeneTools社にて合成したPLP1を標的とするvivo-morpholinoをマウス脳内に直接投与し、その安全性と効果をけんしょうしたが、通常濃度のvivo-morpholino投与にて、投与後死亡個体が多くでた。死亡個体では、脳内の投与部位の組織破壊が生じていることが判明した。投与法など検討が必要であることが判明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

効率的な遺伝子発現抑制効果をもつモルフォリーノの配列を決定し、これを用いたvivo-morpholinoを合成した。また、出生直後の新生仔マウスへの脳内投与に関する技術を確立した。これらの過程はほぼ予定通りに順調に運んだ。一方で、vivo-morpholinoの組織毒性の可能性が浮上しており、検討が必要となっている。

Strategy for Future Research Activity

新生仔マウスの脳内への薬剤投与技術を確立することができたが、vivo-morpholinoの組織毒性という予想しなかった問題に直面しており、投与量や投与法の再検討が必要になっている。また、vivo-morpholinoの臨床応用が困難なようであれば、shRNAなど他のアンチセンスを用いる必要性に関しても検討していく予定である。

Causes of Carryover

vivoモルフォリーノをPLP1トランスジェニックマウスに投与して、治療効果を検証する計画であったが、実験に使用するマウスの交配で予定通りに変異個体が得られず、十分な個体数を確保することができなかった。また、vivoモルフォリーノに、当初予想していなかった細胞障害性が存在することが明らかとなり、当初の計画通りに実施できず、研究計画の変更が必要になった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

物品費８００千円（内訳　組織学的解析用抗体など　４００千円、定量PCRなど分子生物学的解析用試薬　４００千円）

Research Products

• [Journal Article] Attenuation of endoplasmic reticulum stress in Pelizaeus-Merzbacher disease by an anti-malaria drug, chloroquine. (2014)
  • Author(s): Morimura T, Numata Y, Nakamura S, Hirano E, Gotoh L, Goto Y, Urushitani M, Inoue K
  • Journal Title: Exp Biol Med Volume: 239 Pages: 489-501
  • DOI: 10.1177/1535370213520108
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epidemiological, clinical, and genetic landscapes of hypomyelinating leukodystrophies. (2014)
  • Author(s): Numata Y, Gotoh L, Iwaki A, Kurosawa K, Takanashi JI, Deguchi K, Yamamoto T, Osaka H, Inoue K
  • Journal Title: J Neurol Volume: 261 Pages: 752-758
  • DOI: 10.1007/s00415-014-7263-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Involvement of ER stress in dysmyelination of Pelizaeus-Merzbacher disease with PLP1 missense mutations shown by iPSC-derived oligodendrocytes. (2014)
  • Author(s): Kuroiwa-Numasawa Y, Okada Y, Shibata S, Kishi N, Akamatsu W, Shoji M, Nakanishi A, Oyama M, Osaka H, Inoue K, Takahashi K, Yamanaka S, Kosaki K, Takahashi T, Okano H.
  • Journal Title: StemCellReports Volume: 2 Pages: 1-14
  • DOI: doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.03.007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] SLC16A2 mutations in two Japanese patients with Allan–Herndon–Dudley syndrome. (2014)
  • Author(s): Yamamoto T, Shimojima K, Umemura A, Uematsu M, Nakayama T, Inoue K.
  • Journal Title: HumGenVar Volume: 1 Pages: 14010
  • DOI: 10.1038/hgv.2014.10
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] PLP1点変異の新規分子病態を標的としたドラッグ・リポジショニングによるPelizaeus-Merzbacher病の治療法開発 (2014)
  • Author(s): 井上 健、マンガリイ・プリアンティ、沼田有里佳、中村祥子、守村敏史、佐谷秀行、後藤雄一
  • Organizer: 第59回日本人類遺伝学会
  • Place of Presentation: 東京（タワーホール船堀）
  • Year and Date: 2014-11-19 – 2014-11-22
• [Presentation] dditive toxicity of SOX10 mutation underlies a complex neurological phenotype of PCWH (2014)
  • Author(s): Inoue K, Ito Y, Inoue N, Inoue YU, Nakamura S, Matsuda Y, Inagaki M, Ohkubo T, Asami J, Terakawa YW, Kohsaka S, Goto Y, Akazawa C, Inoue T.
  • Organizer: The 64th American Society of Human Genetics Annual Meeting
  • Place of Presentation: San Diego Convention Center, San Diego, USA
  • Year and Date: 2014-10-18 – 2014-10-22
• [Presentation] bronx waltzerマウス変異遺伝子Srrm4の脳内発現とGABAergic interneuronへの影響 (2014)
  • Author(s): 白川 由佳、泉 仁美、中村 祥子、井上 健、後藤 雄一、稲垣 真澄
  • Organizer: 第37回神経科学会大会
  • Place of Presentation: 横浜（パシフィコ横浜）
  • Year and Date: 2014-09-11 – 2014-09-13
• [Presentation] PLP1 missense mutations impair subcellular organelle dynamics that impact clinical severity of Pelizaeus-Merzbacher disease. (2014)
  • Author(s): Inoue K, Numata Y, Morimura T, Nakamura S, Goto Y
  • Organizer: 20th Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience
  • Place of Presentation: Hilton Montreal Bonaventure, Montreal, Canada
  • Year and Date: 2014-07-19 – 2014-07-24
• [Presentation] Abnormal neuronal migration with ischemic brain injury in extremely preterm infants underlies subsequent cognitive impairment. (2014)
  • Author(s): K. Deguchi , K Kubo, K Nakajima K. Inoue.
  • Organizer: 20th Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience
  • Place of Presentation: Hilton Montreal Bonaventure, Montreal, Canada
  • Year and Date: 2014-07-19 – 2014-07-24
• [Presentation] Pelizaeus-Merzbacher-like病：GJC2遺伝子の新規プロモーター変異とその分子病態 (2014)
  • Author(s): 井上 健、後藤玲央、Helman G, Mora S, Maski K, Soul JS, Bloom M, Evans SH, 後藤雄一, Caldovic L, Hobson GM, Vanderver A.
  • Organizer: 第56回日本小児神経学会総会
  • Place of Presentation: 浜松（アクトシティ浜松）
  • Year and Date: 2014-05-29 – 2014-05-31