2013 Fiscal Year Research-status Report

免疫学的手法を駆使したセンチネルリンパ節内小転移病巣の可視化技術の確立

Research Project

Project/Area Number	25670545
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Research Institution	National Center of Neurology and Psychiatry
Principal Investigator	藤井博史独立行政法人国立がん研究センター, 臨床開発センター, 分野長 (80218982)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	センチネルリンパ節 / 画像診断 / 免疫応答 / イメージング / 転移モデル / 可視化
Research Abstract	がんのリンパ節転移が初発するセンチネルリンパ節(SLN)内の小転移病巣のin vivo可視化は、SLN生検の省略も可能とし、更なる低侵襲癌治療に繋がる。その一方、近年、SLN内の小転移病巣の存在が必ずしも予後を増悪させないことも報告されている。本研究課題では、SLN内の免疫反応を解析し、がんの予後不良に関連する免疫応答の発見とその反応に対応した信号の可視化技術の確立を目的とする。平成25年度は、B16悪性黒色腫細胞株-C57BL/6マウス足蹠皮下接種モデルを使用し、SLN内の免疫応答の変化を経時的に解析した。フローサイトメトリー解析により、SLNへのB16-F10 (強転移株)の転移が進むにつれて、B220陽性細胞がCD3陽性細胞よりも顕著に増加することが確認され、この細胞がCD19陽性でもあったことからB細胞であることが確認できた。さらに、B16-F1(低転移株)、B16-F0(弱転移株)を使用した場合と比較しても、転移が進んだSLN内では、胚中心の形成とその増強が免疫組織化学的解析によって明らかとなった。また、乳癌細胞株であるEMT6のBALB/cマウス移植モデルを使用し、同様に小転移の進行に伴ってB細胞が増加することが確認されたことから、他の癌種でもこの反応が生じることを明らかにした。さらに、蛍光タンパク質(tdTomato)をEMT6に遺伝子導入し、その安定発現株の樹立に成功したため、転移の状態が追跡可能なin vivo可視化モデルを樹立することが出来た。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 転移能の異なるB16悪性黒色腫細胞株を比較した結果、効率的に経時解析を行うには強転移株であるB16F10が適していることが判明し、計画的なモデル動物実験が可能となったため。また、EMT6-tdTomato安定発現株の樹立にも成功し、in vivo可視化モデルにもめどがたった。当初計画していたトランスジェニックマウスモデル（OT-I,OT-II TCR Tgマウス）に関しては想定される標的分子に対して適切でないと考えられたため、計画を遂行してはいないが、他のトランスジェニックモデルを使用する計画を立てている。
Strategy for Future Research Activity	B16F10移植モデルに加え、まだ、比較的解析の少ないEMT6移植モデルの解析を進めたうえで、当初計画していた通りに研究を進める。さらに、イメージングプローブ作製の上ではB細胞、および、その標的分子の活性化に相互作用する細胞等にも注目する必要があるため、活性化B細胞のSLNにおける局在などに関しても解析を進める。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	H25年度は、野生型マウスを使用した実験が中心であったため、物品費が予定より低く抑えられ、次年度使用額が発生した。 26年度ではトランスジェニックマウスを使用した解析も行う予定である。また、イメージングプローブの標的となる分子の分子生物学的手法による解析やRNAiなどによる遺伝子工学的な解析も必要になる可能性がある。