2014 Fiscal Year Research-status Report
免疫学的手法を駆使したセンチネルリンパ節内小転移病巣の可視化技術の確立
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25670545
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
藤井 博史 独立行政法人国立がん研究センター, 臨床開発センター, 分野長 (80218982)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | センチネルリンパ節 / 微小転移 / 免疫応答 / 転移モデル / 胚中心 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多くの癌で所属リンパ節の転移状態が重要な予後因子となっているため、センチネルリンパ節（SLN）生検を行い、できるだけ低侵襲で効率よく所属リンパ節の転移状態を評価することが求められている。その一方、SLN内への転移が認められる場合でも予後の増悪に結びつかないことが近年報告されている。
本研究課題では、SLN内における癌の予後不良に関連する免疫応答の発見と、その応答もしくはそれに相関する反応を可視化する技術の確立を目的とする。平成26年度は、乳がん細胞株であるEMT6をBALB/cマウスの足蹠皮下に移植した動物モデルを中心に経時解析を進めた。これまでにB細胞が増加することが確認されていたが、この増加する細胞がIgM陽性、IgD陽性のナイーブB細胞であることが明らかになった。また、時間経過とともに形成される胚中心（GC）が増加することが免疫組織化学的解析によって確認された。さらに、フローサイトメトリー解析によって、胚中心B細胞（GL7陽性、PNA陽性）（GCB）が有意に増加していることが示された。
このGCBの増加はB16悪性黒色腫細胞株-C57BL/6マウスモデルにおいても有意な増加であった。これらの免疫応答が転移とは関係のない炎症反応でも生じるか調べるため、マウスの足蹠皮下に完全フロイントアジュバント（CFA）を接種した皮下炎症誘導モデルを作製し、がん転移モデル同様、膝窩リンパ節を対象に同様の経時解析を進めた。その結果、経時的なナイーブB細胞の増加は確認されたものの、GCの形成やGCBの割合はがん転移モデルと比較し、明らかに小さかった。また、蛍光タンパク質(tdTomato)発現EMT6を使用したマウスモデルではGCにtdTomatoの蛍光が確認されたことから、これらの結果にがん細胞が大きく関与していることが明らかにされた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
B16悪性黒色腫細胞株を使用して得られた知見が、乳がん細胞株であるEMT6を使用した移植モデルでも同様に得られたことから悪性黒色腫に特異的な反応ではないことが示された。また、CFAを使用した皮下炎症誘導モデルと比較した結果、GCB数ががん移植モデルで有意に増加していたことから、がんの転移と相関性が高いことが示唆された。一方、EMT6-tdTomato安定発現株を使用した転移の可視化モデルは対象とする転移の大きさが小さい（細胞数が少ない）ことからin vivo可視化は難しかった。しかしこのモデルの使用により、蛍光タンパク質がGCで確認されたことから、その形成にがん細胞が寄与していることを裏付ける結果が得られた。当初計画していたイメージングのターゲット分子の選定はAID分子をはじめとし、イメージング方法の選択とともに検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
がん細胞（B16F10、EMT6）移植モデルと皮下炎症誘導モデルの解析を進め、GCの形成やGCBの増加における相違点をより明確にする。さらに臨床検体での解析も視野に入れる。これにより、現在のSLN生検における治療方針の決定に対して付加的な情報を提供することや悪性腫瘍の予後と関連の強い現象を見出すことを目指す。また、今回明らかになったGCならびにGCBが発現する分子や相互作用する細胞等を対象として、当初計画していた通りイメージングプローブの作製を目指す。
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| Causes of Carryover |
H26年度に確認された知見を体系的に解析するため、実験動物（野生型マウス）が必要となる。また、イメージングプローブの標的となる分子の免疫学的手法や分子生物学的手法、および、遺伝子工学的手法による解析を行うため、抗体や反応試薬、合成オリゴヌクレオチドなどが必要になる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験動物（野生型マウス）の購入費として、40万円、また、イメージングプローブの標的となる分子の免疫学的手法や分子生物学的手法、および、遺伝子工学的手法による解析を行うための抗体や反応試薬、合成オリゴヌクレオチドなどのトレーサー及び試薬費用などで80万円を予定している。
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