2013 Fiscal Year Research-status Report

Tissue Engineering をもちいた抗腫瘍免疫応答の誘導

Research Project

Project/Area Number	25670558
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Research Institution	Fukushima Medical University
Principal Investigator	後藤満一福島県立医科大学, 医学部, 教授 (50162160)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	見城明福島県立医科大学, 医学部, 准教授 (40305355) 木村隆福島県立医科大学, 医学部, 助教 (00381369) 穴澤貴行福島県立医科大学, 医学部, 助教 (90566811) 土屋貴男福島県立医科大学, 医学部, 博士研究員 (70343390)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords	腫瘍免疫 / 徐放物質 / フィブリン / OK-432
Research Abstract	本研究は、細胞遊走や増殖に関わるサイトカインなどのリザーバーとしての機能、異物拡散防止、および細胞浸潤の足場としての働きがあるフィブリンを徐放物質の足場と位置づけ、Streptococcus pyogenes S株のペニシリン処理凍結乾燥粉末であり、免疫細胞を活性化しサイトカインの産生を促すOK-432を用いて、固形がんに対する免疫療法の開発に向けた基礎研究を行うことが目的である。肝細胞癌に対して、フィブリンとOK-432を用いて動脈塞栓術を施行した後に手術で病変を切除することで、手術単独を行った群と比較して術後再発が優位に抑制されることを報告してきた。摘出標本の検索で、腫瘍内に樹状細胞・細胞障害性T細胞・マクロファージが出現し、抑制性T細胞が減少していたことから、再発抑制には免疫系の関与が示唆され、自然免疫誘導後に獲得免疫である腫瘍免疫が誘導されている可能性を検討することを目的とした。平成25年度は、①フィブリン内のOK-432の存在様式確認、②OK-432/フィブリンへの白血球集積と活性化モニタリング、③末梢血単核球分画より誘導した樹状細胞を用いて抗原特異的細胞障害性T細胞誘導の確認が目的であった。フィブリン網、フィブリンに付着したOK-432の状態を電子顕微鏡で観察した。また、マクロファージ系細胞株J774.1・蛍光標識したOK-432を用いて貪食形式および細胞の活性化(遊走能獲得)の観察を行った。また、J774.1培養系で培養液上清のサイトカインを測定し検討を行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 平成25年度は、①フィブリン内のOK-432の存在様式確認、②OK-432/フィブリンへの白血球集積と活性化モニタリング、③末梢血単核球分画より誘導した樹状細胞を用いて抗原特異的細胞障害性T細胞誘導の確認が研究の目的であった。 ① フィブリン内のOK-432の存在様式確認：フィブリンの濃度を希釈し電子顕微鏡でその構造を観察した。OK-432は不均一にフィブリン内に存在しており、初期免疫担当細胞であるマクロファージの浸潤を考慮し、希釈倍率を決定した。また、マクロファージ系細胞株J774.1を用いてOK-432の貪食形式も電子顕微鏡で観察した。 ② J774.1を蛍光ラベルしたOK-432/フィブリン存在下に培養することで、経時的にフィブリン内に細胞が浸潤していくことを観察した。辺縁よりフィブリン分解しOK-432を貪食することで遊走能が増していた。サイトカインの測定を実施したが、培養液の条件、OK-432の濃度、反応時間を決定した。OK-432の濃度を0.01KEに固定し、培養液中のFBSを1%とし3日まで培養しサイトカイン測定を行うこととした。この条件でIL-6, IL-10, IL-12p40が測定可能であった。 ③ 抗原特異的細胞障害性T細胞の誘導に関しては、上記研究①②に時間を要したため実施していない。予定した研究である③がまだ実施できていないことからやや遅れていると判断している。
Strategy for Future Research Activity	平成26年度の研究内容としては、①Mouse Dorsal Skin Fold Chamberに埋め込みintravital microscopy にて経時的に白血球浸潤の観察、②HepG2株肝移入兎へのfibrin scaffold溶剤を用いた肝動脈注による抗腫瘍効果と免疫応答を観察、③生体投与を念頭においた粉末製剤の作成を計画していた。しかし、平成25年度の研究進行状況が遅れており、平成25年度の予定であった1) OK-432/フィブリンの構造把握、2) OK-432/フィブリンによる免疫活性化の確認のための実験を継続して研究を行うこととする。また、予定していた動物実験であるが、担癌動物モデル作成に時間を要すると考えられるため、OK-432/フィブリン製剤をラット門脈より注入し、それによる組織変化を観察し、生体内での反応を観察することとした。