2014 Fiscal Year Research-status Report

分子進化の概念に基づく新規遺伝子の探索と機能解析

Research Project

Project/Area Number	25670574
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	横山幸浩名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (80378091)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	梛野正人名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20237564) 國料俊男名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師 (60378023)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	分子進化
Outline of Annual Research Achievements	原始地球での生命誕生にはアミノ酸が大きく関与したと考えられており、平成25年度と検討したアミノ酸を含めて、アスパラギン、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン、イソロイシン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、システイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、プロリン、メチオニン、リジン、ロイシン、トリプトファン、バリン、トレオニン、フェニルアラニンについて検討した。Raw細胞2×10５個に各種類のアミノ酸を10、20、40mMで投与を行い、30分後にLPSを10ng/ml加えて4時間培養を行った。それぞれのRaw細胞におけるviabilityをトリパンブルー色素排出法で、エンドセリン1の発現をrealtime　PCR法にて検討した。ロイシンに関しては40mMにおいてviability は80％であり、LPSを10ng/mlの投与の有無によるviabilityに差を認めなかったが、チロシンに関しては10mMにおいて100％の細胞死が誘導された。またLPSを投与後のエンドセリン1の発現に関して、アミノ酸の種類によって濃度依存的にエンドセリン1の発現が異なっており、ヒスチジンではエンドセリン1の発現が亢進していたが、システイン、ロイシンなどでは濃度依存的にエンドセリン1の発現が減弱していた。特にシステインに関しては40mM により、LPSによるエンドセリン1の発現を完全に抑制していた。プロリンやセリンではLPS投与により非投与と比較して、エンドセリン1の発現は亢進していたが、濃度依存的な差は認めなかった。Raw細胞にロイシン、アラニン、グリシン、システインを10、20、40mMで投与を行い、iNOSに関してrealtime　PCR法にて検討した。ロイシン、システインでは濃度依存的にiNOSの発現が減弱しており、システインでは40mMで90％発現を抑制していた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 平成25年度と検討したアミノ酸を含めて、アスパラギン、アスパラギン酸、アラニン、アルギニン、イソロイシン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、システイン、セリン、チロシン、ヒスチジン、プロリン、メチオニン、リジン、ロイシン、トリプトファン、バリン、トレオニン、フェニルアラニンによる検討を行った。LPS投与後のエンドセリン1の発現がアミノ酸により異なり、システイン40mM でLPSによるエンドセリン1の発現を完全に抑制し、iNOS発現を90％抑制することを明らかにした。しかし各条件で培養した細胞株での未知の新規遺伝子の探索ができなかったため、やや遅れている。
Strategy for Future Research Activity	システイン投与によるエンドセリン1、iNOSの発現制御に関するメカニズムを検討する。システイン代謝に関連しているタウリンの検討を行う。L-システイン、D-システインの検討やEGR1の発現に関しても検討を行う。細胞内外のカルシウムの動向と関連している可能性があり、培養液中のカルシウム濃度の変化について検討する。また制御を行っていると考えられるOrai1(Calcium release-activated calcium channel protein1)、STIM1(Stromal interaction molecule 1)、TRP（Transient receptor protein）など細胞膜上のカルシウムチャネル、IP3R(Inositol trisphosphate receptor)、RYR（Ryanodine receptor）などの小胞体上のカルシウムチャネル、CaT1(Calcium transporter prtein1 )などのカルシウムトランスポーターなどについて行う。カルシウムチャネルやトランスポーターの発現についてウェスタンブロッティング法、リアルタイムPCR法により検討する。アミノ酸付加、特にシステインで培養した細胞株を用いて未知の新規遺伝子の探索を行う。新規遺伝子をヒト正常由来細胞株群へ導入し、同定した新規遺伝子の発現をウェスタンブロッティング法、リアルタイムPCR法により検討する。また増殖能（MTTアッセイ法）、アポトーシス（TUNEL法）への影響を検討する。増殖能、アポトーシスへの影響を確認後、この新規遺伝子を導入したヒト由来細胞株群のDNAアレイ法による網羅的遺伝子解析をおこない、新規遺伝子が誘導する増殖能、アポトーシス関連遺伝子を同定する。さらにパスウェイ解析により新たなシグナルについて検討する。