2013 Fiscal Year Research-status Report

自然免疫支配下のT細胞の存在意義の追求‐なぜ肝障害を制御できるのか？‐

Research Project

Project/Area Number	25670590
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Research Institution	The Tazuke Kofukai
Principal Investigator	寺嶋宏明公益財団法人田附興風会, 医学研究所第1研究部, 研究主幹 (40314215)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	内田洋一朗公益財団法人田附興風会, 医学研究所第1研究部, 主任研究員 (30597745)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords	虚血再灌流障害 / 肝臓 / Galectin-9 / T細胞 / TIM / TLR-4 / マクロファージ
Research Abstract	本研究は、自然免疫支配を受ける肝虚血再灌流障害におけるT細胞とマクロファージのcross-talkの調節機構を解明する研究である。実験モデルとしては、マウス70%肝部分虚血再灌流障害モデルを作成し、方法としては全身麻酔下に開腹、肝70%領域を支配する門脈・胆管・肝動脈を一括クランプして閉腹、90 分後に再開腹しデクランプにより再灌流を行い、1,2.4,6,8,12,24時間に評価する。初年度の研究成果の一つは、wild type(black 6)におけるマウスモデルの作成が安定したことである。血中AST/ALT値を測定し再灌流6時間後に最高値になり、HE染色による組織学的検査で血清データに相関した肝組織障害を確認でき、実験手技の統一、室温など実験環境の整備を行い、コントロールモデルの完成に至った。さらに、Recombinant Galectin-9(Gal-9)製剤の投与群と非投与群において、このモデルを作成すると、再灌流6時間後においてRecombinant Gal-9投与群において、有意な肝機能障害の改善を認めた。Gal-9がTIM-3 ligandとして、T細胞とマクロファージの相互作用を制御し、肝障害を改善することが推察された結果であった。現在は、Gal-9 ノックアウト(KO)マウスにおいて同モデルを作成し検討を行っている所である。また、当研究所の動物施設でTLR-4 KOマウスの繁殖開始に至った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 肝虚血再灌流障害モデルは非常にシンプルではあるが、種々のパラメーターに依存するため、コントロールが安定するまでの習得と調整に時間を要した。しかしながらvivoにおいてGal-9投与による非常に興味深い結果が得られているため、投与タイミングや投与量などの詳細な検討が必要であった。また、TLR-4 KOマウスの繁殖には時間を要しているが、順調に増加していると思われる。
Strategy for Future Research Activity	今年度は、現在進行中であるGal-9 KOマウスを使用しての同様のモデル作成から、wild typeとの比較を行う。続けてRecombinant Gal-9投与群および非投与群における比較検討を行う。現在繁殖しているTLR-4 KOマウスは順調に増加しており、今夏には使用可能となる見込みであるため、同様に検討を行う。TIM(T cell Immunoglobulin Mucin)-3 KOマウスおよびTh17 KOマウスについては現在購入調整中である。 in vivo実験で得られた肝組織を用いて、研究計画に基づきサイトカイン測定、アポトーシス解析、各種蛋白測定、免疫染色などを行う。in vitroでの検討として、マウス脾細胞を採取し、Concanavalin A(Con-A)刺激によるINF-γなどのサイトカイン産生を調べる。次にGal-9 のTIM-3+CD4+細胞に対する直接的な影響を解析するため、Gal-9によるapoptosisの誘導をflow cytemetryにて解析する予定である。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	マウスモデル作成およびRecombinant Galectin-9製剤の投与タイミングや投与量の検討を中心に行っていたため。またノックアウトマウスの繁殖準備にも時間を要したため。初年度に十分に行えなかったベンチワークに対して使用予定である。得られたサンプルを用いて、各種assay（抗体・試薬購入など）に使用したいと考えている。