脳微小血管内皮細胞の老化、細胞特性におけるSIRT1の病態的役割についての解明

2014 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 25670612
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 寳金 清博 北海道大学, 大学病院, 教授 (90229146)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中山 若樹 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (40421961) ; 数又 研 北海道大学, 大学病院, 講師 (60634144) ; 鐙谷 武雄 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (80270726) ; 七戸 秀夫 北海道大学, 大学病院, 助教 (80374479)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 脳微小血管 / 細胞老化 / SIRT1

Outline of Annual Research Achievements

ウシ脳微小血管内皮細胞（BMEC）を使用し、5継代の正常BMECと15継代の過継代 BMECを用いて、酸素グルコース欠乏（OGD）3時間刺激における細胞応答の違いを経時的に比較し、細胞老化の影響とSIRT-1の発現の関連を検討した。
①cell viabilityの検討・・live and dead kitを使用して検討を行ったが、正常BMECに比べて過継代BMECにおいて、OGD刺激後に経時的にlive cells が少なくなり、 dead cellsが多くなっていた。②アポトーシスの検討・・FLICA kitを使用してアポトーシスの発生の状況を検討したが、正常BMECに比べて過継代BMECにおいて、経時的にアポトーシスがより発生していた。③活性酸素産生（ROS）についての検討・・DHEを用いてROS産生の状況を検討した。その結果、正常BMECに比べて過継代BMECにおいてROS産生の著しい増加を認めた。この産生増加はOGD直後、すなわち再酸素化0時間が最大で、その後経時的に減少した。一方、正常BMECでは4～6時間で軽度増加した。ミトコンドリア由来ROSを認識するMitoTrackerを使って測定すると、過継代BMECではDHEで測定した時の変動と同様の変動を示し、過継代BMECのROS産生増大はミトコンドリア由来と考えられた。一方、正常BMECではMitoTrackerでは変動に乏しく、DHEでのROS産生の変動はミトコンドリア由来ではないと考えられた。④SIRT-1発現の検討・・ウエスタンブロッティングにてSIRT-１の発現を測定した。過継代BMECでは発現量が少なく、ほとんど変化しなかったが、正常BMECでは、2～4時間で発現の増加を認めた。
上記の結果からは、過継代BMECでは、OGDの刺激に対して、ミトコンドリア由来ROS産生増加と細胞障害性変化を起こしやすいことが分かった。一方、正常BMECではOGDの刺激の後にSIRT-1の発現亢進が一過性にみられたが、これは細胞保護的に作用している可能性が考えられた。現在、この結果をまとめて、学会発表と英語論文の準備をしている。