肺組織由来のトリプシン高度耐性多能性幹細胞を用いた急性肺傷害治療法の確立

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25670665
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 田中 園美 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 医員 (80644103)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 寛人 東京医科歯科大学, 医歯学融合教育支援センター, 助教 (80632174)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 間葉系幹細胞 / 前駆細胞 / 蛋白分解酵素

Research Abstract

平成25年度は、ラットを用いた肺トリプシン高度耐性細胞の分離および表面抗原による細胞の形質の検討を行った。
深麻酔下にラットを安楽死させ、摘出した肺を細断し、エラスターゼ処理を行ってえられた細胞懸濁液に対して、16時間のトリプシン処理を行い、ウシ胎児血清で中和の後、10%FBS添加αMEM培地で培養する。このようにして得られた細胞について、継代を10回までの範囲で培養を維持し、以下の検討を行い、幹細胞様の形質の有無や肺胞上皮への作用について評価した。
①フローサイトメトリーを用いた表面抗原によるタイピング：CD29, CD45, CD54, CD90に対する蛍光標識抗体を用いてフローサイトメトリーを行い、表面抗原によるタイピングを行い、必要に応じて特定のサブグループの細胞をソーティングして培養する。②浮遊培養による桑実胚様コロニー形成の検討：メチルセルロース含有培地の使用により浮遊培養を行い、幹細胞様の形質として、桑実胚様のコロニーを形成するかどうかを検討した。桑実胚様のコロニーがいったん形成されたが、大きさは変わらず、この方法での培養では、細胞の増殖は否定的であった。②トリプシン高度耐性細胞と肺胞上皮初代培養：トリプシン高度耐性細胞と肺胞上皮初代培養の共培養を行い、上皮におけるサーファクタントプロテインの発現が長期間(21日間)の培養でも維持された。この細胞は、肺胞の上皮機能の維持または活性化を誘導する性質があると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成25年度は研究代表者の田中が産休・育休をとったため、共同研究者(山本)により、上記の結果を得た。田中は、平成26年4月より復職しており、引き続き研究を進めるものとする。

Strategy for Future Research Activity

平成26年度は、ラット・エンドトキシン肺傷害モデルに投与した場合の治療効果の検討を行う。
キシラジン・ケタミン麻酔下に、気管挿管し、5mg/mlのlypopolysaccharideを300ul　経気道的に投与する。4時間後に治療細胞の投与を行い、麻酔から覚醒させて、自発呼吸下に24-48時間飼育する。治療に用いる細胞は、EGFP発現ラット由来のものとし、5000細胞/ulに調整し、気管カニューレから500ul投与する。細胞投与24または48時間後に、ラットを深麻酔下に屠殺し、肺組織をホルマリン固定し、組織標本を作成する。肺組織の評価は、肺組織に及んだ傷害度、GFP陽性細胞の生着度について、連続切片を作成して検討する。また、別個のシリーズとして、屠殺直後に肺胞洗浄を行って肺胞中の炎症性メディエータ（TNF-α,IL-1β）および肺傷害マーカー（RAGE）についてもELISA法で検討する。
治療効果が有効と判定された場合には、同様に肺傷害モデルを作成し、細胞治療後、1か月の飼育を行い、ラットを深麻酔下に屠殺したのち、肺組織を採取し、組織標本を作成して、上記と同様の評価を行い、肺組織の過剰な線維化の有無などの観点から、安全性に関する検討を行う。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

産前産後の休暇又は育児休業による中断により、田中園美分の研究費は平成２５年０４月１８日以降は使用されなかった。
田中は、平成26年4月より研究を含めた業務に復帰しており、引き続き、平成２６年度の計画に沿った研究を進めるものとする。