2013 Fiscal Year Research-status Report

MRTF分子による細胞骨格制御シグナルを標的とした前立腺癌転移抑制法の探求

Research Project

Project/Area Number	25670687
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
Research Institution	Kyoto Prefectural University of Medicine
Principal Investigator	三木恒治京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10243239)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	木村泰典京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20398374) 鴨井和実京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (40295663) 上田崇京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50601598)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2015-03-31
Keywords	MRTF分子 / 前立腺癌治療 / 細胞骨格 / 癌転移抑制
Research Abstract	我々は in vitroにおいて、前立腺癌の腫瘍形成や転移といった悪性化を抑制するたんぱく質としてMyocardin Related Transcription Factor（MRTF）を発見した。MRTFはアクチンを束ねるCaldesmon(CaD)やTropomyosin(TM)の発現を上昇させ、細胞骨格を強固にすることで前立腺癌の悪性化を防ぐ働きをしている。MRTFのたんぱく質量や活性を上昇させる技術は前立腺癌転移を防ぎ、死亡率を減少させるような画期的治療の開発につながるものと期待される。本研究の目的は、MRTFを介する細胞骨格制御signal passwayの解明と、マウスを用いたMRTFの癌浸潤・転移抑制効果の検討を基礎研究として、将来的にMRTFを分子標的とした新しい癌転移抑制治療法の開発に結び付けることである。平成25年度は前立腺癌細胞株LNCaPを前立腺癌細胞モデルとして用いて、MRTFの癌転移を抑制するsignal passwayの解明を行なうことと、次年度のマウスを使った生体内での癌転移抑制効果の実験のためluciferaseとMRTFを強制発現させるためのレトロウイルスベクターの構築を目標とした。具体的にはLNCaP細胞株のゲノムからMRTFプロモーター領域のクローニングを試みた。またLNCaP細胞においてMRTFの過剰発現またはsiRNA を用いてMRTFのノックダウンを行い、マトリゲルアッセイにて細胞の浸潤能を観察した。その結果LNCaPに細胞おけるMRTFのノックダウンは前立腺癌細胞の浸潤能を抑制することが判明した。MRTFプロモーター領域のクローニングに関しては難渋中であり、BACクローンを用いたクローニングを施行中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason LNCaP細胞からゲノムを抽出し、MRTFプロモーター領域のクローニングを試みたが、PCRの段階で難渋した。制限酵素で切断する等も試みたがPARが走らず、現在BACクローンを購入し、再施行中である。
Strategy for Future Research Activity	平成26年度は、実際にマウスの心腔内にMRTFを過剰発現させた転移性前立腺癌細胞株PC-3を投与し、癌の転移が抑制されるかを確認する実験を行なう。GFPを発現する空ベクターを発現させたPC-3前立腺癌細胞株とMRTFを強制発現させたPC-3前立腺癌細胞株とで浸潤能の比較を行う。次にマウスを用いて生体内でMRTFは前立腺癌の転移を抑制する効果をもつことを証明する。MRTFをレトロウイルスベクターに乗せて転移性前立腺癌細胞株PC-3に遺伝子導入し、その細胞を心腔内投与する。これにより転移巣が形成されるが、MRTF強制発現群ではコントロール群に比べ、転移が抑制されることを証明する。これらin vitro, in vivoの基礎研究データが前立腺癌転移を抑制するMRTFをターゲットとした分子標的治療薬の開発の臨床応用へとつながっていくものと考えられる。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	購入予定薬品・物品等の変更、価格の変更があり、残額が生じた。 MRTF強制発現が実際に前立腺癌転移を抑制するかヌードマウスへの移植実験を行うためマウスの購入費として使用する予定。レトロウィウルスヴェクターの作成に関しては消耗品に使用する予定である。