2013 Fiscal Year Research-status Report
In vitro内耳発生システムの開発とWntシグナルによる内耳発生機序の解明
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25670720
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
吉川 正英 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (50230701)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
王寺 幸輝 奈良県立医科大学, 医学部, 講師 (50343421)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 内耳 / 発生 / 器官培養 / 細胞培養 / 有毛細胞 / Wntシグナル / 耳科学 |
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| Research Abstract |
内耳の発生および構造は複雑で、内耳研究に取り組むハードルを高める要因である。本研究では、内耳の発生を試験管内で再現・模倣し、それらの細胞が形態形成を行うプロセスを解明すべく、内耳幹細胞（耳胞細胞otic vesicle cells：OVC）を用いたin vitro内耳発生モデルの構築を目的とした。
まず初年度（平成25年度）は、耳胞細胞（OVC）の単離・培養に着手した。マウス胎児からマイクロダイセクションにより耳胞細胞（OVC）を単離し、培養条件を検討後、増殖活性の高いcloneを選択し、長期間培養可能な株化細胞（OVC1）を樹立した。遺伝子解析の結果、OVC1は、神経幹細胞のマーカーを発現し、内耳内成熟細胞のマーカーの発現は認められない未熟な細胞であることが明らかとなった。また、内耳細胞の中でも特に難聴に関わる内耳有毛細胞に着目し、特異的なマーカー遺伝子（Math1）のプロモーター活性により蛍光タンパク質を発現可能なplasmid constructを作成した。この遺伝子をOCV1細胞へtransfectionし、薬剤耐性細胞（M-OVC1）を樹立した。続けて、このM-OVC1細胞をin vitro培養系で各種Wntを添加培養した結果、ある種のWntが増殖活性を抑制し、分化を誘導することが明らかとなった。
次年度（平成26年度）、OVC1細胞を用いた内耳細胞への分化プロセスをより精査し、さらに、多細胞との共培養による分化誘導の効率化およびWntシグナルの意義を検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画に基づき、期待した実験成果が得られており、学会発表および論文発表での成果報告を行っているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度（平成26年度）では、M-OVC1とエフェクター細胞（EFC）の共培養により内耳初期形成モデルを構築し（in vitro内耳発生システム）、さらに、Wntシグナルならびに細胞間ネットワークの影響を細胞／組織レベルで、時間的・空間的に可視化・解析することで、内耳形成メカニズムを解明する。
具体的には、内耳の発生を模倣するに当たって、M-OVC1と、ある種のエフェクター細胞（EFC）を混合培養することで、各種Wntシグナルの影響を解析する。また、樹立したM-OVC1細胞およびエフェクター細胞（EFC）を蛍光標識することで分別可能としたこれらの細胞を混合培養し、複雑な内耳初期発生の影響を精査する。さらに、内耳細胞分化・発生におけるWntの影響を調べるため、Wntをin vitro培養システムに取り入れることで、内耳発生への影響を精査する。FACSあるいはレーザーマイクロダイセクションにより細胞分離・分取し、リアルタイムPCR、DNA arrayなどを用いた遺伝子解析を行い、発生した内耳細胞間のキャラクタリゼーション、内耳形成における分化プロセスを解析する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究計画の後半（平成26年度）において、内耳発生に関わる遺伝子変化を詳細に解析する目的で、DNA array等、受託研究費および抗体などの消耗品購入が予想された。それらは高額になると考えられたため、本研究計画の前半（平成25年度）の研究費用をできるだけ抑えるように腐心した。
平成25年度は、細胞材料の準備やその維持のために、培養液やプラスチックシャーレ等の消耗品購入費用が生じたが、計画的かつ必要最小限の量を購入することで、繰越金を捻出した。本年度（平成26年度）、DNA arrayなどの受託研究費が発生することも鑑み、繰越金を使用して更なる解析を進める。その際、本研究計画の前半に購入した消耗品を継続して使用することや、実験に必要な物品を計画的に追加購入することで、研究を遂行する。
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[Journal Article] Cytotoxic human peripheral blood-derived γδT cells kill glioblastoma cell lines: implications for cell-based immunotherapy for patients with glioblastoma2014
Author(s)
Nakazawa T, Nakamura M, Park YS, Motoyama Y, Hironaka Y, Nishimura F, Nakagawa I, Yamada S, Matsuda R, Tamura K, Sugimoto T, Takeshima Y, Marutani A, Tsujimura T, Ouji N, Ouji Y, Yoshikawa M, Nakase H
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Journal Title
J Neurooncol
Volume: 116
Pages: 31-39
DOI
Peer Reviewed
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