2013 Fiscal Year Research-status Report
視細胞前駆細胞株をもちいた杆体細胞錐体細胞分化機構の解明
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25670740
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
廣津 千恵子 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 研究技術員 (90647174)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 次世代シークエンサー / ロドプシン / iPS細胞 / ES細胞 / 網膜前駆細胞 / 全トランスクリプトーム解析 |
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| Research Abstract |
網膜細胞の分化機構の詳細は不分明である。我々はマウスのES細胞とiPS細胞に眼発生に関わる重要な転写因子の一つである pax6を遺伝子導入した後、限界希釈法を用いることで nestin, musashi1, six3, 網膜前駆細胞の分化に関わる転写因子 chx10を同時に発現する網膜神経前駆細胞株を複数樹立する事に成功した（Kayama M, Suzuki N, et al. Ophthalmic Res 2010, Suzuki N et al. Neuroscience Letters 2013）第一グループの細胞株は視細胞前駆細胞としての性質を持ち杆体視細胞と錐体視細胞へと分化できる。第二グループの細胞株は優先的に網膜神経節細胞に自発的に分化する。その分化機構を転写因子レベルとエピジェネティック調節のレベルで解析する。これらの細胞株を用いて、網膜神経節細胞、視細胞前駆細胞、杆体視細胞と錐体視細胞を高純度で精製できる状態になった。Ｉｏｎ ＰＧＭシステム次世代シークエンサーを用いて各細胞の全転写パターンを分析し、細胞間の差異を明らかにする。現在は予備実験としてシクエンスの解析を行っているが、近々に網膜前駆細胞を用いたマッピングとデーター解析を行う。それらの情報に基づ き眼組織での役割を免疫組織染色で解析する。これらの Bioinformaticな解析により、神経節細胞や視細胞の分子レベルでの関連を、さらに眼発生の分子機構の理解が可能になる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々がマウスiPS細胞から作成した株化 pax6導入細胞の一部は視細胞前駆細胞の分化段階に対応する細胞株で杆体視細胞と錐体視細胞に分化するがその分化機構の詳細は明らかではない。これらの視細胞前駆細胞株をケモカイン等で刺激してそれぞれの視細胞への分化を誘導する。この細胞は 90％程度の純度には容易に分化誘導できるが、これに抗 CD73抗体とセルソーターを用いれば 95％以上の精製が可能となった。高純度な網膜の構成細胞を、具体的には網膜神経節細胞、杆体視細胞と錐体視細胞を用いて網羅的なトランスクリプトーム解析を次世代シークエンサーを用いて行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
迅速に大規模な量の配列解析能力をもつ次世代シーケンサーは、近年多くの生物学研究領域で目覚ましい進展を見せており、これを用いて次世代の網膜細胞分化メカニズムの解析を行う。まず全RNA から特有のキットを用いてcDNAライブラリを合成した後でＩｏｎ ＰＧＭシステムを用いて全配列を解析する。当初はイルミナを使用予定であったが、本学にＩｏｎ ＰＧＭシステムが導入され、現在これを使用している。現在は予備実験としてシクエンスの解析を行っているが、近々に網膜前駆細胞を用いたマッピングとデーター解析を行う。これをＩｏｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙの次世代シーケンシング対応Whole Transcriptome解析クラウドサービスを用いてデータベース化した後に必要な情報のみを取捨選択し解析を行う。網膜神経節細胞や杆体視細胞と錐体視細胞分化の分子メカニズムの解析は網羅的トランスクリプトーム解析の導入により初めて可能になる。さらに同定された mRNA・蛋白質の役割については RT-PCR、免疫染色、ウエスタン法、フローサイトメーターを中心に in vitro, in vivoで同定・解析して行く。即ち、網羅的トランスクリプトーム解析と並行してRT-PCR、免疫染色などのコンベンショナルな解析を行い、それらの成績を組み合わせて、相互の比較から夫々の細胞分化のキーファクターを同定する。
Whole Transcriptome解析と並行して、そこでの情報を随時フィードバックしながら現在行なっている基本的な細胞培養法を用いた増殖・分化に関わる因子をコンベンショナルな方法で同定する。視細胞前駆細胞ではsonic hedgehogは分化の初期に必須で CXCR4の発現を調節しており、SDF1存在下にSFD1/CXCR4経路を介して強い増殖と杆体視細胞への分化が起こる。今後は錐体視細胞への分化に着目して実験を行う。
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