非接着培養で形成される凝集塊の未分化性獲得機構の解明

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25670754
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 貴志 和生 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40224919)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 林 瑠加 慶應義塾大学, 医学部, 助教 (50445392) ; 荒牧 典子 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (80365311)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 幹細胞 / 毛包 / 再生

Research Abstract

生後6週令のオスのC57bl/6Jマウスより、背部の真皮を採取し、真皮間葉系細胞を10%FBS含有のDMEM培地で接着培養を行い、10継代目の細胞をトリプシン処理により細胞を浮遊させ、培養を開始した。その中からクローンを形成する細胞１０種類を無作為に選択し、2次元接着培養を継続し、細胞を増殖させた。その後、EGF, bFGF, B27を添加したDMEM/F12混合培地を用いて、寒天でコーティングしたディッシュの上に細胞を播種し、細胞凝集塊を形成させる。培養開始後3週で細胞を回収し、4％パラフォルムアルデヒドで細胞を固定し、一部はwhole mountで免疫染色を行い、一部はパラフィン包埋し、2 μｍの切片を作成し、ともにこれまで未分化マーカーとして報告されているさまざまな因子につき免疫染色を行った。
具体的には、胚性幹細胞で発現している、Oct-3,SOX2,Nanog,Klf4,c-Myc,神経幹細胞で発現しているNotch1,2,3,CD133,CXCR4,間葉系幹細胞で発現しているCXCR4,CD133などにつき、免疫多重染色を行う。その後、コンフォーカルマイクロスコープで、細胞凝集塊の中で各タンパクの発現部位の差異について検討した。これら因子につき、real time RTPCRを用いて、凝集塊総量の遺伝子発現の変化について定量的に観察した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウス真皮間葉系細胞を接着培養を行い、培養することができ、その中からクローンを形成する細胞１０種類を無作為に選択した。その後細胞凝集塊を形成させ、Oct-3,SOX2,Nanog,Klf4,c-Myc,Notch1,2,3,CD133,CXCR4,CXCR4,CD133につき、免疫多重染色を行い、細胞凝集塊の中で各タンパクの発現部位の差異について検討し、real time RTPCRを用いて、凝集塊総量の遺伝子発現の変化について定量的に観察することができている。

Strategy for Future Research Activity

特に変更なく、予定通り研究を進行してゆく。さらに、それぞれのクローンから作成した細胞凝集塊の毛包誘導能の有無について検討する。FACSによりSSEA-1陽性細胞と、陰性細胞を分離し、それぞれの細胞集団から同様にクローンを作成、増殖させ、その後に凝集塊を作成させ、この２者の凝集塊の未分化性の相違を観察する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

使用する抗体が、以前に使用したもので賄えるものがあったため。
平成26年度以降の動物実験に充当したい。