2013 Fiscal Year Research-status Report
臍帯由来間葉系細胞中Muse細胞の特性解析と歯周組織再生医療応用への展開
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25670836
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Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
金指 幹元 鶴見大学, 歯学部, 講師 (80339811)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田畑 泰彦 京都大学, 再生医科学研究所, 教授 (50211371)
出沢 真理 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50272323)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | MUSE細胞 / 臍帯 / 臍帯由来間葉系細胞 / 歯周組織再生 / 再生医学・医療 / 歯学 / 再生医工学 / ゼラチンハイドロゲル |
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| Research Abstract |
本研究は鶴見大学歯学部倫理審査委員会の審査と承認（受付番号1112）のもとに行った。臍帯は連携医療機関で妊婦に対して、対照の歯根膜および歯髄組織は本学矯正科受診患者に対して十分なインフォームドコンセントを行った後書面にて同意の得られた被験者より得た。細胞数を得るため臍帯組織はトロント大学の方法（以下1st.）それを改良したfrozen vessel explant（以下2nd.）そして臍帯全てを細切する（以下full explant）3つから初代細胞を得た。抜去歯からの細胞は Gronthos らの方法に従い初代細胞を得た。臍帯由来細胞、歯根膜、歯髄細胞は通常培養し３～６継代の細胞を本研究に用いた。歯髄細胞（n=6）、歯根膜細胞（n=3）、臍帯（total n=7、1st.=2、2nd.=3、full explant=2）はそれぞれSSEA-3を用いてセルソーティングした。臍帯7例のうち2nd.の方法からは3検体から全て初代細胞を得ることが出来なかった。1st.およびfull explantの方法では初代細胞を得ることができた。さらにGronthosの方法で歯髄検体、歯根膜3検体全てから初代細胞を得ることが出来た。東北大学のプロトコールに従い細胞を染色後セルソーターでSSEA-3陽性、陰性細胞に分けた後に96well plateにシングルセルで播種し、１週間後のES細胞様形態を示すクラスター形成細胞をカウントして形成率を求めた。歯髄細胞ではSSEA-3陽性率が0.2～2.6％、歯根膜細胞では0.2～0.7％認められたが、1st.の細胞では0.01～0.05％であり、full explant細胞では0.2～0.3％認められており、現在96 well plateでのクラスター形成率を求めているところである。
細胞の足場として、我々が臨床研究で用いているゼラチンハイドロゲルを検討したところ、安全性、有効性が認められたため、本研究では細胞ゼラチン粒子混合塊を作り塊内部にまで十分培養液が浸透する新たな移植塊作製技術を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ほぼ予定通りに進行している。
予備的検討からStem Cells(2005,23(2):220-9)に書かれた1st.の方法で一定程度のMuse細胞の確認をしていたものの検体数を増やした結果、本方法ではMuse細胞の元となるSSEA-3陽性細胞が少ないことが判明し、現在トロント大学で行われているfrozen vessel explantで細胞を得ることとした。しかしながらトロント大学で処理した臍帯と違い、本学で得られる臍帯では臍静脈壁の厚さに違いがあり、2nd.の方法では細胞を得ることが出来なかった。そのため外膜を取り除いたfull explantで評価したところ、3つの方法で最もSSEA-3陽性細胞が多かったため、現在この方法で検体数を増やし、クラスター形成率を求めている。
細胞移植の際に必要な足場としてゼラチンを予定しているが、すでにゼラチンハイドロゲルとして臨床研究を行い、その有効性について学会発表した。またこのゼラチンハイドロゲルを用いた歯周組織再生に関する10例の臨床研究は公益財団 臨床薬理研究振興財団研究大賞を受賞した。
総合的に判断して、おおむね順調に進展している、と思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
臍帯組織から細胞を得る方法をfull explantに統一し、今年度目標数を5検体とする。また今年度はコントロールの細胞に歯根膜、歯髄由来細胞に加え、現在臨床研究されているヒト骨髄由来間葉系細胞を加え、さらにすべての細胞のクラスター形成率、クラスターより得られるMUSE細胞の３胚葉分化の検証を分子生物学的に行う予定である。
ゼラチンハイドロゲルと細胞の複合体の評価として、複合体中心部の細胞死が問題となる。そこでゼラチン粒子の大きさを3種類（<20μm、20～32μm、32～53μm）、さらにβTCPを含有させ機械的強度を高めたゼラチンスポンジを用意して複合体を作し、細胞生存率を評価し最も有効な粒子径を決定する予定である。この評価に際してin vitroだけでなく、in vivoでも検討が必要であるため、本学動物実験委員会の審査をえて移植実験も予定している。
以上の方策で、本研究から得られたデータから新たな歯周組織再生療法へ展開出来ると考えている。
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