2013 Fiscal Year Annual Research Report
Clostridium属細菌を用いた未利用バイオマスからのブタノール生産系の開発
| Project/Area Number |
25701017
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
|
| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
|---|
Principal Investigator |
中山 俊一 東京農業大学, 応用生物科学部, 助教 (90508243)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | 発酵 / バイオマス / メタボローム / 遺伝子発現 / 応用微生物 |
|---|
| Research Abstract |
本年度は、セルロース系未利用バイオマスからの高効率ブタノール生産系の開発を目的とし、以下の研究を行った。
まず、セルロース分解に関与する各種セルラーゼを発現させるためのプロモーターを探索した。ゲノム情報より構成的な発現を制御するsigma Aプロモーターコンセンサス配列と相同性を高い相同性を示すプロモーター12種類を選別し、GFPをレポーター遺伝子として発現量を測定した。その結果、Phosphotransferase system II C-component、acetyl-CoA acetyltransferaseのプロモーターが培養を通じて高発現するプロモーターであることを見出し、このプロモーターを用いた発現ベクターを構築した。構築した高発現ベクターを用いて次年度からセルラーゼ等各種遺伝子の発現を行うことが可能となった。
セルロース分解は高温域が至適温度であるが、ブタノール生産菌は37℃以上ではブタノール生産性が顕著に低下する。そこで、メタボローム解析により、高温培養時のブタノール発酵阻害経路の推定を試みた。その結果、解糖系・ペントースリン酸経路・核酸・アミノ酸・ピリジンヌクレオチドなど菌体の生育や増殖の必須物質も減少していた。不足していた代謝物の内特にアデニンを添加することで37℃でもブタノール生産が可能であることを見出した。このことから、特に高温培養時に不足する代謝物はアデニンであることを明らかにすることができた。
中温性セルロース分解菌のスクリーニングも行い、嫌気性中温性のセルロース分解菌も取得した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
セルロース系バイオマスを基質とした高効率ブタノール生産系の開発を目的とし、セルラーゼ活性の強化を、①ブタノール生産菌におけるセルラーゼ高発現②ブタノール生産菌における高温域での発酵能強化を行った。本年度では、遺伝子を高発現するためのプロモーター配列を2種類選別し高発現ベクターを構築した。このベクターの開発により遺伝子発現が容易になり様々なセルラーゼ遺伝子を発現させることが可能となった。また、高温でのブタノール発酵を停滞させている原因がアデニン生合成であることを見出しており、アデニン生合成に関与する代謝経路に着目し遺伝子発現量を網羅的に比較し、発現量の低い遺伝子を先に構築した発現ベクターを用いて相補することで、アデニン添加によらない高温ブタノール発酵が可能となる。
ブタノール生産菌との混合培養によりブタノール生産可能な中温性セルロース分解菌の取得には至っていないが、ろ紙を基質とし中温性嫌気性セルロース分解菌は取得している。スクリーニングあるいは変異処理等を継続することで高効率な分解菌を取得することが期待される。
以上の様にほぼ当初の計画通り進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１．セルラーゼ高分泌性・耐熱性ブタノール生産菌への育種
前年度異種タンパク高発現用プロモーターを２種類選別し、発現ベクターを構築した。今後、構築した発現ベクターに各種セルラーゼ遺伝子を連結後ブタノール生産菌に導入し、糖化力を補強できるブタノール生産菌を育種する。育種株とセルロース分解菌を混合培養することで、糖化効率・ブタノール生産速度が向上するかを検討する。
前年度において高温で生育させた場合、代謝が停止し各種一次代謝物生成が減少するが、この減少した代謝物の中でもアデニンを添加することで高温での生育が回復し効率的にブタノール生産を行えることを見出した。そこで、アデニン生合成までのどの経路が律速になるかを遺伝子発現量の比較および酵素活性の測定により明らかにする。律速の原因が発現量の低下であれば、先の高発現用プラスミドを用いて相補する。酵素活性の低下であれば、耐熱性の菌を遺伝子資源とし発現させることで耐熱性を付与する。また、変異処理による耐熱性ブタノール生産菌の取得も試みる。
２．中温性セルロース分解菌の取得と分解能の向上
新規な中温性嫌気性セルロース分解菌を単離し、変異処理を組み合わせてセルロース分解能が向上した菌への育種を行う。前年度では、セルロース分解菌は単離できるものの、ブタノール生産菌との混合培養でセルロースからブタノール生産可能な中温性セルロース分解菌は取得できていないため、継続してスクリーニングを行う。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度は研究が期待通りの進捗し、かつ次年度の補助金額は本年度よりも大幅に減額するため、次年度の物品費購入に充てるため次年度使用額を生じさせた。
次年度使用額を用いて、発酵産物定量のハイスループット化を目的とし高速液体クロマトグラフ用オートサンプラ―の購入に充てる。
|
Research Products
(2 results)
