2013 Fiscal Year Annual Research Report
ユビキチンプロテアソーム経路を利用した新規遺伝子発現制御に基づく細胞制御法の開発
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25702028
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Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
樋口 ゆり子 京都大学, 学際融合教育研究推進センター 健康長寿社会の総合医療開発ユニット, 講師 (40402797)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ユビキチンープロテアソーム経路 / 遺伝子発現制御 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、疾患に特有の微小環境に応答して遺伝子発現を制御できるシステムの構築により、幹細胞を利用した新規DDSシステムを開発することである。
IkappaBは、TNFalphaによる刺激が契機となり、ユビキチン―プロテアソーム経路により分解される。そこで、本年度は、IkappaBの配列のうち、ユビキチンープロテアソーム経路による分解に必要だと考えられる配列、PUb、ANK1~6、PESTの各組合せ配列と、蛍光タンパク質mKO2の融合タンパク質を発現するベクターを作成した。それぞれを発現させた細胞に、TNFaplaを添加し、蛍光強度をタイムラプスイメージングで評価したところ、PESTを含まない融合タンパク質を発現させた細胞では、蛍光強度が全く変化しなかった。一方、IkappaB全配列または、UbPとANK1,2とPESTまたは、UbPとPESTを融合させた蛍光タンパク質を発現した細胞では、時間の経過と共に蛍光強度が減少した。さらに、後者の２つの融合タンパク質は、IkappaB全配列との融合タンパク質の場合と比較して速やかに減少した。また、後者の２つの融合タンパク質の減少は、内在性のIkappaBの減少と比較的近かった。以上、TNFalpha刺激による分解に必要なドメインとしてUbP、ANK1,2、PESTを候補として今後利用する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通り、IkappaBの各ドメインのうち、分解に必要な配列の決定を行った。また、必要なドメインと蛍光タンパク質の融合タンパク質が、TNFalphaの刺激で分解されることも確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
２年目には、今年度得られた結果に基づき、IkappaBの分解に必要なドメインをリプレッサーに結合させた融合タンパク質発現ベクターを構築し、TNFalphaの刺激により遺伝子発現がonになるシステムを構築する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
１年目に機器の購入を予定していたが、実験条件などが決まらず、機器の選定が遅れたため。
実験条件が決定しだい、機器の選定を進め購入する予定である。
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