2015 Fiscal Year Annual Research Report
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25710022
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
澤井 哲 東京大学, 大学院総合文化研究科, 准教授 (20500367)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / 走化性 / 細胞性粘菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
微小流路にバッファーとcAMP溶液を二股チャンネルからそれぞれ送液して層流を形成し、拡散によって2層流の境界にcAMP濃度勾配を作成した。この状況のもとで、細胞先端を特徴付ける、活性型Rasに選択的に結合するヒトのRaf-1タンパク質のRas結合ドメイン(RBD)に赤色蛍光タンパク質RFPを融合させたもの、ならびに、アクチン結合ペプチドにGFPを融合させたRFPRaf-1RBDの両方を共発現させた細胞生粘菌株を用い、一方向的に運動している様子のタイムラプス測定により、膜付近における蛍光輝度値分布を計測した。同時に、青色蛍光分子ATTO425をcAMP溶液と混合し、細胞外cAMP濃度の指標とした。これによって、活性型RasとF-actin、細胞外cAMPそれぞれの空間分布を3波長で経時的に測定するための条件出しをおこなった。前年度まで問題となっていた勾配の揺らぎについては、サンプル調整、デバイス調整の工程の詳細を改良し、ほぼ問題のないところまで改善できた。また、Ras以外に、Racとの同時測定系を立ち上げ、データ取得と相関解析を進めた。その結果、ある一定の条件においては、細胞の運動やアクチンとの連動はRas活性よりもRacの方が強いことが明らかになった。また、上流と下流の関係については、観察している断面以外のデータがないことからくる不完備さが問題としてあり、３次元データの取得のための条件出しを進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
データ取得に当初計画で想定していた以上の手間を要したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までの測定と解析を発展させ、昨年度導入の100倍レンズ、さらに今年度導入予定のピエゾステージによって膜付近における蛍光輝度血の３次元的な分布を経時的に追跡する。また波長の重なりの問題があったAttoに変えて、昨年度導入の640nmレーザーを用いて、近赤外領域のAlexaを用いたイメージぐに切り替えることで、cAMP刺激の可視化と、細胞内反応の可視化の重なりを最低限に抑える工夫を重ねる。これまでの解析の限界であったデータの不完全性を克服すべく、受容体直下の３層のシグナル伝達の関係を、様々な刺激下で定量化したデータを得る。Ras, Rac, PI3K, Scar/WAVEについてデータ取得を重ね、３次元的な細胞運動の出力がいかに上流から下流へのシグナルの受け渡しによって形作られているかを、情報量による特徴づけを行う。
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| Causes of Carryover |
データの解析を進めるうちに、細胞の３次元的なデータを取る必要性が明らかになってきた。そのためには、高速の電動ステージが必要となるが、すぐに導入するには高額のため他の実験を圧迫してしまうことが予想され、翌年度の支出状況を見極めながら導入を計画することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞の３次元データの時系列取得と解析のためのデバイス、パソコンの導入、並びに通常の細胞培養、遺伝子操作のため試薬類。
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