2014 Fiscal Year Annual Research Report

細胞周期依存的なコヒーシン一分子ダイナミクスの解析

Research Project

Project/Area Number	25711002
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	西山朋子名古屋大学, 高等研究院(理), 特任講師 (90615535)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2017-03-31
Keywords	染色体構築
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、姉妹染色分体間接着を担うコヒーシン複合体のダイナミクスを、一分子レベルで理解することを目的とする。コヒーシン複合体は細胞周期を通じてその局在やDNAに対する結合性を変化させ、姉妹染色分体間接着の必要な時に、必要な場所で、コヒーシン結合因子や修飾因子と協調しながら接着を達成している。しかしながら従来の細胞生物学的、生化学的解析では、コヒーシン複合体の挙動を分子集団として捉えることしかできず、コヒーシン分子が実際にどのようにDNA上で挙動し、接着に寄与しているのか、その詳細は明らかにできない。本研究ではDNA上のコヒーシンを一分子レベルで観察する系を確立し、その細胞周期に応じた挙動を明らかにするとともに、そのダイナミクスを制御するメカニズムを明らかにすることを目指す。平成26年度においては、一分子観察系においてD NA複製を行う系の構築を試みた。アフリカツメガエル卵抽出液より調整した核抽出液を、倒立顕微鏡上にセットしたFlow chamberに流すことで、顕微鏡下でDNA複製を進行させる系を構築できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成26年度の目標はコヒーシン一分子の細胞周期を通じた挙動について、おもにS期におけるダイナミクスを明らかにすることであった。そのために重要なDNA複製を顕微鏡下で再現することができ、あとはこの系において、コヒーシン複合体のダイナミクスを観察するのみである。
Strategy for Future Research Activity	平成26年度に構築したDNA複製系を用いて、接着の確立を、蛍光標識したSororinのローディングで可視化する。接着確立前後でコヒーシンの DNA 上での安定性を比較するとともに、接着確立におけるコヒーシンのリング構造が必要かどうかを、TEVプロテアーゼ処理により検討する。
Causes of Carryover	抗体作製を外注していたが、ウサギが途中で死亡したため、再度免疫をやりなおし、計画全体が平成27年度に先送りとなった。劣化が予想されていた全反射顕微鏡用の固体レーザーが、予想外に高い耐久性を示し、平成26年度購入の必要がなくなった。
Expenditure Plan for Carryover Budget	27年度以降、引き続き固体レーザーの劣化が予想されるため、レーザー購入に充てる予定である。また、細胞培養に用いるクリーンベンチの必要性が高まっているため、その購入に充てる予定である。