2013 Fiscal Year Annual Research Report
細胞死を検出する自然免疫システムの低温電子顕微鏡法による構造生物学的基盤研究
| Project/Area Number |
25711010
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
藤井 高志 独立行政法人理化学研究所, 生命システム研究センター, 基礎科学特別研究員 (10582611)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 低温電子顕微鏡法 / アクチン / 単粒子解析法 / DNGR-1 |
|---|
| Research Abstract |
免疫システムには外敵から身を守るだけでなく、細胞の健康状態を常時監視し”傷ついた”細胞を検出し除去するメカニズムがある。樹状細胞上にあるDNGR-1受容体が細胞骨格を構成するアクチン繊維（アクチン単量体ではない！）をリガンドとして認識し、”傷ついた”細胞を検出している。低温電顕単粒子解析法によりアクチン繊維・DNGR-1複合体の高分解能構造解析を行い、その原子レベルでの相互作用様式を調べた。
まず、アクチン繊維とDNGR-1複合体を作成し、重金属を用いて染色する負染色像の観察を行った。高コントラスト画像を取得できる負染色像において、DNGR-1の結合に伴う形態の差異があることを確認した。低温電子顕微鏡法では無染色氷包埋像を撮影するため低コントラストであり、DNGR-1の結合を容易に確かめることはできない。そのため負染色観察は非常に重要な予備実験である。DNGR-1は溶液中で2量体を形成しており、アクチン繊維と結合した時、もう片方のDNGR-1が他のアクチン繊維と結合しバンドル化することが懸念されたが、繊維は単分散しており、バンドル状の凝集体を形成していないことを確認した。
この単分散した繊維を低温電子顕微鏡法で観察を行い画像取得を行った。3次元立体構造解析により、１２Å分解能で繊維構造の密度マップを得た。アクチン繊維は2本の素繊維がリボンのように絡み合った構造をしているが、DNGR-1はその2本の素繊維の間にはまり込むように結合していた。この事実はDNGR-1がアクチン繊維にのみ結合しアクチン単量体に結合しないというこれまでの知見を構造生物学的に証明している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度の達成度としてはおおむね順調に進展していると考えている。構造解析をおこなう上でのDNGR-1とアクチン繊維のキャラクタリゼーションを完了することができている。キャラクタリゼーションには溶液の塩濃度、pHなどの複合体安定化条件の最適化から、氷の厚さの微妙な調節なども含まれる。これらのリファイメントは低温電子顕微鏡法により高分解能データを得るために必須で有り、初期段階に必ずクリアしておかなければならない点である。また、すでに繊維複合体の氷包埋試料作製の最適化に成功しており、十分な繊維密度で低温電子顕微鏡によるデータ取得ができている。画像取得の大規模化を行うことで分解能の向上を図ることができる。また、膨大な画像データからの繊維像の切り出しなどを自動化するツールなどを作製したことにより、省力化を行うことができるようになっており、データ解析を大きく加速した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
αヘリックスやβシート構造が可視化可能な10オングストロームより良い分解能での構造解析を目指す。試料調整の条件だしを初年度に細かく行ったため、本年度はデータ収集がスムーズに行う事ができる。低温電子顕微鏡法では高分解能化するために大量のデータを取得し、それを画像解析技術により分類・整列を行い平均化することにより信号対雑音比を上げる。これにより、照射電子線量の制限のために高いノイズレベルの生画像から、高分解能情報を抽出している。大量データ収集・解析を可能にするために、データ取得の自動化や解析の半自動化など自動化技術の改良にも取り組む。これらの基盤要素技術の開発は本研究のみに役立つだけではなく、幅広く低温電子顕微鏡法の改良・革新に寄与する。また、新型の電子直接検出型CMOSディテクターの導入により、分解能を大きく減衰させていた電顕像の“ぼけ”と“ぶれ”を解消できる目処がたった。これにより、3オングストローム分解能での高分解能構造解析が行える可能性がでてきた。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本研究ではアクチン繊維―DNGR1複合体の低温電子顕微鏡法による高分解能構造解析を目指している。近年、低温電子顕微鏡法による高分解能化は急速に進展している。様々な要素技術の内の一つであるサンプル作製法の高度化も著しい。タンパク質ポリペプチドの主鎖・側鎖が解像できるレベルでの高分解能化を目指すためには、効率的に試料を作製・撮影し、データを解析することが必須である。そのような、世界的研究情勢の変化に対応するべく、新型の氷薄膜作製装置の導入が必須となった。新型の装置を用いる事により、従来では氷薄膜に入りずらかったタンパク質複合体においても氷薄膜試料を作製できる。基金分を次年度に繰り越すことにより、これを購入する。
上記で説明したように、氷薄膜装置を早期に導入し、アクチン繊維―DNGR1複合体の高分解能構造解析を進める。平成25年度分の基金分を平成26年度に繰越し、平成26年度分と併せて、この装置の購入に充てる。また、平成25年度に予備実験を終え、各種パラメータについての精密化を行ったため、平成26年度は大量データ収集のフェーズに入るため、多くの電子顕微鏡関連の消耗品の使用が予想されるためこれにも予算を充てる。
|
