2013 Fiscal Year Annual Research Report
ショウジョウバエ始原生殖細胞におけるミトコンドリア品質管理機構の解析
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25711020
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Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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Research Institution | Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences |
Principal Investigator |
林 良樹 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 助教 (30508817)
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Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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Keywords | 始原生殖細胞 / ショウジョウバエ / ミトコンドリア / 品質管理 / マイトファジー / 解糖系 / メタボロミクス / 細胞死 |
Research Abstract |
個体に含まれるミトコンドリアは、卵を介して母性的に伝達される。正常なミトコンドリアを含む生殖細胞を選別する仕組みは、次世代の個体が正常なミトコンドリアを継承する上で必須であるがその仕組みは明らかになっていない。本研究では、ショウジョウバエをモデルとして、その胚発生過程における始原生殖細胞(PGC)の細胞死誘導が、異常なミトコンドリアをもつ生殖系列を排除するにあたって中心的な役割を果たしているという可能性に着目する。これまでに①ショウジョウバエPGCにおいては、他の体細胞に比べて解糖系中間代謝物質が多く含まれていること、②PGCにおいては解糖系中間代謝酵素をコードする遺伝子(解糖系遺伝子)が高いレベルで発現していること、③解糖系遺伝子はPGCの細胞死誘導に必要なこと、④PGCにおいてはマイトファジー制御因子、およびProgrammed Necrosisを誘導するTNF経路の因子が高いレベルで発現していることが明らかとなっている。これらの結果を受けて、本年度は以下の3点について研究を行った。 1:TNF経路およびマイトファジー制御因子の働きをPGCにおいて阻害した場合の影響の観察を行った。その結果、解析の途中ながら、特にマイトファジー制御因子の働きを阻害した場合、PGCの細胞死が阻害される傾向にあることが観察された。現在、この結果について確認中である。 2:解糖系代謝酵素に対する抗体を作成し、タンパク質レベルで解糖系酵素がPGCに高レベルで発現するか観察することを試みた。この結果、いくつかの酵素については免疫化学染色に用いられる抗体を取得することに成功した。現在、これらの抗体を用いて解析を行っている。 3:PGC中でのミトコンドリア量を定量的に観察するための免疫化学染色法および観察法を検討した。その結果、胚深部にあるPGC中のミトコンドリアを観察するのに適した方法を見いだした。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度は、以下の3点に注力して解析を行った。 1:TNF経路およびマイトファジー制御因子の働きをPGCにおいて阻害した場合の影響の観察を行った。 2:解糖系代謝酵素に対する抗体を作成し、タンパク質レベルで解糖系酵素がPGCに高レベルで発現するか観察することを試みた。 3:PGC中でのミトコンドリア量を定量的に観察するための免疫化学染色法および観察法を検討した。 その結果、1の解析において、PGC中でマイトファジー制御因子の働きを阻害した場合、胚発生過程におけるPGC数の減少が減弱する傾向があることが観察された。このことはマイトファジー誘導機構が胚発生過程におけるPGCの細胞死誘導の仕組みの一端を担っている可能性を示唆している。現在、この結果について、確認を進めているところである。また2の研究から、解糖系代謝酵素群のうちいくつかのものについては、免疫化学染色に使用可能な抗体を得ることに成功した。またそれら抗体を用いた実験により、解糖系代謝酵素のうちEnolase等の複数のものは、mRNAに加えてタンパク質もPGCにおいて強く発現していることを確認した。現在、この解析を継続しており、解糖系代謝酵素群全体のタンパク質レベルでの挙動を明らかに出来ると考えている。また3の解析で、免疫化学染色の過程、およびサンプルの封入法を改良した結果、従来の方法に比べて、より胚深部に存在するPGC中のミトコンドリアを観察することが可能になった。これはPGC中のミトコンドリアを定量的に観察するにあたっては重要な改良である。今後はこの方法を用いて、胚発生過程におけるPGC中でのミトコンドリアを定量的に観察することにより、PGC中でマイトファジー依存的なミトコンドリア品質管理がなされているかどうか、そしてそれがPGCの細胞死誘導に関与するかどうかについて明らかにしていこうと考えている。
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Strategy for Future Research Activity |
上記のように25年度において、研究を推進する上で重要なプログレスがあった。しかし、まだ以下に示す解決する必要があるいくつかの問題が残されている。そのうちの一つは、マイトファジー制御因子およびTNF制御因子のPGCの細胞死誘導における役割の解析である。現在のところ、各機構に関与する中心的な因子の機能解析のみ、部分的に終了している。たとえばマイトファジー制御因子としてはAtg12、そしてTNF制御因子としてはbskである。今後、これらの結果を確認するとともに、マイトファジーおよびTNF経路に関わる他の因子(例えばParkin、Pink1やeiger等)についても同様に解析を行い、これら機構がPGCの細胞死誘導に関与するかどうかを明らかにしていく予定である。またこれら制御機構が解糖系によって制御されるかどうかを各機構の因子の発現や活性が、解糖系をノックダウンした場合に変化するかどうかを調べることにより、明らかにしていく予定である。また代謝酵素に対する抗体の解析も継続し、PGCの発生過程における解糖系代謝酵素群の挙動の全貌を明らかにする必要がある。これらの知見は、PGCにおける解糖系の亢進が、生殖系列の発生プログラムの下流にあるのかどうかを検証するにあたっても重要な下地になるものであると考える。26年度以降に解決しなくてはならない大きな問題は、PGCにおけるミトコンドリアの定量的観察についてである。25年度の段階で、染色法、封入法の改良により、これら解析を行う上で基礎となる方法は確立できたと考えている。26年度は、これらの方法を使用すること、そして新たにセットアップした顕微鏡および高感度CMOSカメラを用いて、PGC中のミトコンドリアの定量的解析を行っていきたいと考えている。
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Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
受託解析を予定していたメタボローム解析が、細胞取得用のセルソーターの購入時期の遅れのため、サンプル取得に予定以上の時間がかかり実施出来なかったことが一因である。また顕微鏡周辺機器については、主要な機器の選定、購入が遅れたため部分的に購入することが出来なかった メタボローム解析の受託解析については、セルソーターのセットアップの完了したため、サンプルが取得出来次第、解析をおこなう予定である。また顕微鏡周辺機器については、実験の進捗状況や必要性に応じて随時、購入し解析に用いる予定である
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] Analysys of Drosophila glucuronyl C-5 epimerase: implication of developmental roles of heparan sulfate sulfation compensation and 2-O sulfated glucuronic acid.2013
Author(s)
Dejima, K., Takemura, M., Nakato, E., Peterson, J., Hayashi, Y., Toyoda, A., Toyoda, H., Nakato, H.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 288
Pages: 34384-34393
DOI
Peer Reviewed
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