2014 Fiscal Year Annual Research Report
ショウジョウバエ始原生殖細胞におけるミトコンドリア品質管理機構の解析
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25711020
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| Research Institution | Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
林 良樹 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 助教 (30508817)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 始原生殖細胞 / ミトコンドリア / 解糖系 / 細胞内代謝 / 品質管理 / マイトファジー / ネクローシス / メタボロミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
個体がもつミトコンドリアは卵を介して母性的に伝達される。正常なミトコンドリアをもつ生殖細胞が選別される仕組みは、次世代の個体が正常なミトコンドリアを受け継ぐ上で重要であるが、そのメカニズムは不明である。本研究では、ショウジョウバエの胚発生過程における始原生殖細胞（以下、PGC）の細胞死誘導が正常なミトコンドリアをもつ生殖細胞を選別するうえで重要な役割を担っているという可能性に着目して研究を行っている。特にPGCにおける解糖系の亢進が、PGCの細胞死誘導を行うことでこの仕組みにおいて中心的な役割を果たしているという可能性に着目している。これまでに１PGCでは体細胞に比べて解糖系中間代謝物質が多く含まれていること、２PGCにおいては解糖系中間代謝酵素をコードする遺伝子（解糖系遺伝子）の発現が高いこと、３解糖系遺伝子の働きはPGCの細胞死誘導に必要であること、４PGCにおいてはマイトファジー因子およびNecrosis誘導因子の発現が高いこと、が明らかとなっている。これらの結果をうけて本年度は以下の研究を行った。
(1)解糖系代謝酵素に対する抗体を作製し、PGCにおける酵素の発現を観察した。その結果、これら酵素はタンパク質レベルでPGCにおいて高発現していることが明らかとなった。
(2)PGC中におけるミトコンドリアを、昨年度に改良した染色法および観察法によって定量的に観察することを試みた。また画像解析ソフトを用いた定量的画像解析を試みた。
(3)PGCにおける解糖系中間代謝物質の蓄積が、解糖系の亢進によるものであるかどうかを検証するために、PGCにおいて解糖系遺伝子の機能を阻害し、そのようなPGCをセルソーターによって分取し、メタボローム解析を行う準備を完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記のように２６年度において、研究を推進する上で重要なプログレスがあった。特に解糖系遺伝子を阻害したPGCに対するメタボローム解析は、解糖系が実際に亢進しているのか、細胞死誘導に関与する代謝物質はなにであるのか、等を検証する上で重要なポイントとなる。２６年度において、解糖系遺伝子を阻害したPGCをメタボローム解析に供するだけ分取し終えたことは、技術的、労力的に重要な一歩である。２７年度は、このようにして分取したPGCをメタボローム解析に供することで、PGCにおいて解糖系が亢進しているのか、また表現型を引き起こす代謝物質変化はなにであるのかを探求していく予定である。また２５年度において作製した解糖系代謝酵素に対する抗体を用いて、免疫染色法による発現解析を行った。その結果、解糖系遺伝子mRNAにくわえて、代謝酵素の多くはPGCにおいて高いレベルで発現していることが明らかとなった。代謝酵素のうち、免疫染色に用いる抗体が作製出来なかったものについては、再度作製しなおし血清を得ている。２７年度においては、これら新たに作製しなおした抗体も免疫化学染色に供し、発現解析を行う予定である。
一方で、思ったように進捗しなかったポイントとしてはミトコンドリアの定量的観察が挙げられる。２５年度において改良した染色法、観察法を用いて取得した画像を、画像解析ソフトを用いて解析を試みたが、解析の精度を上げることが出来なかった。この点については画像解析を専門とする研究者の助言をうけて解決する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記のように２６年度において進捗した点とともに、課題となる点も明らかとなっている。そこで２７年度では特に以下の点に注力して研究を推進する予定である。
１：解糖系を阻害したPGCに対するメタボローム解析：上記のように解糖系遺伝子を阻害した胚およびコントロール胚から、セルソーターを用いてPGCの分取を終えている。２７年度はこれらPGCをメタボローム解析に供することで代謝物質量の変化を計測する。これにより野生型胚のPGCにおいて観察された解糖系中間代謝物質の蓄積が、実際に解糖系が亢進しているためなのかどうか検証することが出来る。また顕著に変化した代謝物質があった場合、そのような代謝物質が細胞死誘導において果たす役割について解析を進めていく予定である。
２：PGCにおけるミトコンドリアの定量的観察：上記のように、現在までにPGC中のミトコンドリアを観察するための染色法、画像取得法については確立している。取得画像の解析法についてはこれまで3D画像解析ソフトを用いて行おうと試みてきたが、定量的解析を行う上で十分な精度が得られなかった。そこで２７年度は①画像定量解析を専門とする研究者の助言を仰ぎ、解析方法を刷新する。特に取得画像におけるシグナル強度ではなく、形態に重きを置いた解析を行う、②３次元画像解析が困難な場合、２次元画像を用いることでミトコンドリアの半定量的解析を行う、という２つの方針でこの点を克服する予定である。
３：細胞死誘導および品質管理機構に関与する候補遺伝子の遺伝学的解析：上記２によって定量的解析法が確立された場合、この方法を解糖系遺伝子、あるいはネクローシス誘導やミトコンドリア品質管理に関与する遺伝子の機能阻害胚に対して用いることで、それら因子がミトコンドリアの選抜に関与するかどうか検証する。
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| Causes of Carryover |
受託解析を予定していたメタボローム解析は、細胞の取得は完了したものの、研究室の移転などにより実施出来なかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
メタボローム解析については、２７年度の研究が開始し次第行う予定である。
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[Journal Article] Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis.2015
Author(s)
Ohhara, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R., Kayashima, T., Hayashi, Y., Akagi, K., Ueda, Y., Yamakawa-Kobayashi, K., Kobayashi, S.
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Journal Title
Proc. Natl. Acad. Sci.
Volume: 11
Pages: 1452-1457
DOI
Peer Reviewed
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