2014 Fiscal Year Annual Research Report
コヒーシンが染色体接着と二重鎖切断修復に機能する機構の試験管内再構成による解析
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25711022
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
高橋 達郎 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (50452420)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 染色体分配 / DNA修復 / 染色体接着 / ツメガエル / 無細胞系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コヒーシン複合体は複製された姉妹染色分体を接着し、正確な染色体分配を保証するタンパク質である。さらにコヒーシンは二重鎖切断損傷の修復にも必要とされる。しかしコヒーシンが染色体を接着する機構はまだよく分かっておらず、特にその成立過程は未解明である。さらにコヒーシンが二重鎖切断損傷の修復に機能する機構は大部分不明である。そこで本研究では、コヒーシンによる染色体接着、および二重鎖切断修復機構を、ツメガエル卵無細胞系と試験管内再構成系を用いて解析した。
本年度は、(1)コヒーシン染色体結合に機能するScc2-Scc4が、DNA複製と協調して染色体に結合する機構の解析、(2)染色体接着成立に必要なコヒーシンアセチル基転移酵素の作用点の解析と、(3)ツメガエル卵抽出液中で部位特異的な二重鎖切断を引き起こす実験系の構築に取り組んだ。(1) については、Scc2-Scc4と相互作用するDNA複製因子であるCdc7-Drf1の精製方法を検討し、脱リン酸化型のCdc7-Drf1 を効率よく得る方法を確立した。さらに組み換えコヒーシンの発現精製方法を確立し、組み換えコヒーシンがツメガエル卵抽出液中で染色体に機能的に結合することを確認した。(2)については、ツメガエル初期胚の主なコヒーシンアセチル基転移酵素であるXEco2がDNA複製と同時期に機能を果たすことを明らかにした。現在、XEco2と協調して機能するDNA複製因子を探索中である。さらにXEco2の機能モチーフ解析とタンパク質精製を行い、さまざまな変異XEco2タンパク質の高純度精製法を確立した。これらを用いて、既知のDNA複製因子との相互作用の解析を行った。(3)については、制限酵素を用いて姉妹鎖の片側に特異的な二重鎖切断の導入に成功し、その修復過程を解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、当初計画通りコヒーシン染色体結合の再構成に向けて、鍵となるタンパク質（コヒーシン、Cdc7-Drf1、XEco2）の発現、精製方法を確立し、野生型タンパク質に加えて様々な変異型タンパク質の作成にも成功した。また、部位特異的、姉妹DNA鎖特異的な二重鎖切断の導入に成功し、その修復過程の解析に着手した。ほぼ計画通りの進展であり、概ね順調な進展と考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまで基本的に当初計画通りに進展しているため、次年度も当初計画に沿ってコヒーシン染色体結合の再構成、二重鎖切断修復への寄与の解析を進める。またXEco2の解析からいくつかの重要な知見が得られているため、H27年度にこれらを論文として報告する予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は技術補佐員の経験が浅いために業務量を抑えたため、当初予定よりも人件費が低かった。またタンパク質精製が順調に進展したため、コストのかかる抗体作成や、実験系の構築に必要な高額試薬の購入を先送りした。このため次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は技術補佐員の業務量も増えるため人件費が増加する。また予定されていた抗体作成、試薬購入などを行う。
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Research Products
(11 results)
