2014 Fiscal Year Annual Research Report
気道上皮におけるZAPSを介した新規抗ウイルスメカニズムの解析
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25713032
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
早川 清雄 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教 (00368292)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 自然免疫 / インフルエンザウイルス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに細胞内で核酸認識に関わるRIG-Iの活性化をポジティブに調節する分子として、ZAPS（Zincfinger antiviral protein 1, shorter isoform）を見いだした。本研究では、これまでの結果を基盤として、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルスメカニズムを明らかにすることを目的として基礎的研究を進めている。
HEK293T細胞にインフルエンザウイルス由来NS1を単独またはNS1とZAPSを共発現させた後、RIG-Iのリガンドとなる3pRNAやウイルス由来RNAを細胞内に導入すると、NS1単独ではインターフェロンやサイトカイン等のmRNA発現が抑制されるのに対して、ZAPSを共発現させることでmRNA発現を有意に回復させることができた。その条件において、それぞれのタンパク質に対して異なる蛍光タグを結合させて局在の変化を解析すると、RIG-IとNS1の共局在がZAPSによって阻害されることがわかってきた。この結果は、免疫沈降法を用いたウェスタンブロットの結果と同様なメカニズムが細胞内で働いていることを示唆している。現在、これらの会合性が直接的なのか、または間接的なのか解析を進めている。また、ZAPSを過剰発現させたトランスジェニックマウスの解析を進めている。トランスジェニックマウス由来のマウス胎児繊維芽細胞（MEFs）を調整し、核酸で刺激をした結果、インターフェロンやサイトカイン等のmRNA発現の増強が見られた。このことから、実際に in vivo で感染させた時のインターフェロンやサイトカイン等の遺伝子発現の変化やウイルス量の変化について解析を進めていくことを検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルスメカニズムを明らかにすることを目的として実験を進めている。これまでに、共焦点レーザー顕微鏡を用いた解析を進め、細胞内でのタンパク質の局在変化について解析し、免疫沈降法を支持する結果が得られている。さらに、どのドメインが、この活性に重要であるのかについても検討をはじめている。また、当初計画通りin vivo における実験も解析を進めていることから、概ね計画通りに進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の実験結果に基づき、ZAPSとNS1のRIG-Iに対する競合について検討を進める。具体的には、ZAPSとRIG-Iの会合をNS1が直接阻害するのかどうかをin vitroで実験を行うとともに、ZAPSの一部を欠損させた変異体を用いることで競合に必要な部位の同定を検討する。さらに、トランスジェニックマウスを用いた解析を進める。トランスジェニックマウス由来のMEFsを調整し核酸で刺激をした後、インターフェロンを含むサイトカインのmRNA発現をqRT-PCR等で解析し、その結果をもとにin vivoにおけるZAPSの働きを検討する。
また、ウイルスRNAの認識とplatformとしてのantiviral stress granules (avSGs) の関連性が報告されていることから（PloS ONE, vol.7(8), 2012）、脂質代謝シグナル等の関与についても解析することを検討する。
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| Causes of Carryover |
本研究を遂行するにあたり、FACS を用いた解析を検討しているが、導入にあたり予定していた予算以上の金額のため、次年度の予算と合算して購入することを検討した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本研究課題を遂行するために必要なプレートリーダーを研究室で使用できる環境となったため、解析を計画しているFACSの導入または、目的としている分子の細胞内局在を詳細に解析するため超遠心機の導入を検討している。
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