2013 Fiscal Year Annual Research Report
慢性皮膚粘膜カンジダ症の新規責任遺伝子の同定とSTAT1異常に伴う分子病態の解析
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25713039
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Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
岡田 賢 広島大学, 大学病院, 助教 (80457241)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | CMCD / STAT1 / 機能獲得性変異 / カンジダ / 脱リン酸化障害 |
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| Research Abstract |
１）本邦におけるCMCD 患者の遺伝的背景の検討
本邦のSTAT1異常によるCMCD患者10人の解析を行い、フローサイトメトリーにを用いたリン酸化STAT1の検出による迅速診断が有効であることを示し、論文報告を行った。さらに、Casanova教授（海外共同研究者）との共同研究で、次世代シークエンサーを用いたエクソーム配列解析により、CMCDの新規責任遺伝子の同定に成功した。同定した遺伝子は転写因子であり、今年度に詳細な機能解析を行う予定である。
2) STAT1 変異がシグナル伝達に及ぼす影響とその機序について検討
STAT1の過剰なリン酸化のメカニズムを解析するため、STAT1リコンビナント蛋白を精製したのち活性化JAK2とin vitroで反応させ、STAT1リン酸化の速度を検討した。その結果、変異STAT1は野生型STAT1と同等の速度でリン酸化を受けることが明らかとなり、過剰なリン酸化は脱リン酸化障害に由来することが証明された。次に、脱リン酸化障害を証明するため、STAT1の核内脱リン酸化酵素であるTCP45の精製を行った。精製したTCP45をリン酸化されたSTAT1と反応させることで脱リン酸化を検討したが、STAT1の脱リン酸化は検討できなかった。原因は、STAT1リン酸化後もJAK2が持続的に結合しているためであり、様々な実験の条件設定を行ったもののJAK2を外すことができず、検討を断念した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
１）次世代シークエンサーを用いたエクソーム配列解析により、CMCDの新規責任遺伝子の同定に成功した。
２）STAT1機能獲得性変異のスクリーニング法を確立し、論文発表を行った。
３）野生型STAT1と変異STAT1のリン酸化速度をin vitroで測定して、STAT1の過剰なリン酸化が脱リン酸化障害に起因することを明らかとした。残念ながら、STAT1の核内脱リン酸化酵素を用いた脱リン酸化障害のメカニズムの解明には至らなかったが、充分以上の成果と考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) CMCD患者の遺伝的背景の検討
前年度と同様に、フローサイトメトリーを用いた迅速診断と遺伝子解析を組み合わせることにより、STAT1 変異のスクリーニングを継続する。同定されたSTAT1 新規遺伝子変異は、STAT1 欠損細胞株を用いたレポーターアッセイによりGAS転写活性を検討することで評価を行う。さらに必要に応じて、ウエスタンブロット、ゲルシフトアッセイによる機能解析を追加する。STAT1変異が同定されない患者では、次世代シークエンサーを用いたエクソーム配列解析を行い、新規責任遺伝子の同定を試みる。
2) CMCD新規責任遺伝子の機能解析
前年度に同定したCMCD新規責任遺伝子A（遺伝子名は秘匿）は転写因子であり、遺伝子強制発現実験を行い、ゲルシフトアッセイ、レポーターアッセイ、ウエスタンブロットを用いて変異の機能解析を行う。患者末梢血のex vivo解析では、Th17細胞の減少が認められている。患者で認めるTh17細胞減少の詳細を検討するため、患者由来のnaive T細胞をin vitroで分化誘導し、Th1, Th2, Th17細胞への分化状態を検討する。同時に分化した細胞が産生するサイトカイン（IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-17, IL-22）を測定する。上記の機能解析を進めるとともに、変異が同定された患者群の臨床症状を詳細に聴取することで、疾患の全体像を明らかとし論文発表を行う。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
エクソーム解析候補の家系例（家系中４人の解析を予定）で、受診上の都合でエクソーム解析の同意を得るのに時間がかかり、年度中に解析を行うことが出来なかった。そのため次年度使用額が生じた。
次年度使用額が生じた理由の部分で提示したエクソーム解析候補の家系例（４人：既に同意を所得済）のエクソーム解析を行うために使用する。
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] IL-17 T Cells' Defective Differentiation In Vitro Despite Normal Range Ex Vivo in Chronic Mucocutaneous Candidiasis Due to STAT1 Mutation.2014
Author(s)
Mekki N, Ben-Mustapha I, Liu L, Boussofara L, Okada S, Cypowyj S, Ghariani N, Saidi W, Denguezli M, Casanova JL, Puel A, Barbouche MR.
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Journal Title
J Invest Dermatol.
Volume: 134
Pages: 1155-7
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] New and recurrent gain-of-function STAT1 mutations in patients with chronic mucocutaneous candidiasis from Eastern and Central Europe.2013
Author(s)
Soltesz B, Toth B, Shabashova N, Bondarenko A, Okada S, Cypowyj S, Abhyankar A, Csorba G, Tasko S, Sarkadi AK, Mehes L, Rozsival P, Neumann D, Chernyshova L, Tulassay Z, Puel A, Casanova JL, Sediva A, Litzman J, Marodi L.
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Journal Title
J Med Genet.
Volume: 50
Pages: 567-78
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Heterozygosity for the Y701C STAT1 mutation in a multiplex kindred with multifocal osteomyelitis.2013
Author(s)
Hirata O, Okada S, Tsumura M, Kagawa R, Miki M, Kawaguchi H, Nakamura K, Boisson-Dupuis S, Casanova JL, Takihara Y, Kobayashi M.
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Journal Title
Haematologica
Volume: 98
Pages: 1461-9
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Partial IFN-γR2 deficiency is due to protein misfolding and can be rescued by inhibitors of glycosylation.2013
Author(s)
Moncada-Velez M, Martinez-Barricarte R, Bogunovic D, Kong XF, Blancas-Galicia L, Tirpan C, Aksu G, Vincent QB, Boisson B, Itan Y, Ramirez-Alejo N, Okada S, et. al.
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Journal Title
Blood
Volume: 122
Pages: 2390-401
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] A novel homozygous p.R1105X mutation of the AP4E1 gene in twins with hereditary spastic paraplegia and mycobacterial disease.2013
Author(s)
Kong XF, Bousfiha A, Rouissi A, Itan Y, Abhyankar A, Bryant V, Okada S, Ailal F, Bustamante J, Casanova JL, Hirst J, Boisson-Dupuis S.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 8
Pages: e58286
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Age-dependent association between pulmonary tuberculosis and common TOX variants in the 8q12-13 linkage region.2013
Author(s)
Grant AV, El Baghdadi J, Sabri A, El Azbaoui S, Alaoui-Tahiri K, Abderrahmani Rhorfi I, Gharbaoui Y, Abid A, Benkirane M, Raharimanga V, Richard V, Orlova M, Boland A, Migaud M, Okada S, et al.
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Journal Title
Am J Hum Genet.
Volume: 92
Pages: 407-14
DOI
Peer Reviewed
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