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2013 Fiscal Year Research-status Report

植物由来カルス細胞を用いた天然ゴム生合成機構の解明

Research Project

Project/Area Number 25740041
Research Category

Grant-in-Aid for Young Scientists (B)

Research InstitutionYamagata University

Principal Investigator

中村 武志  山形大学, 理学部, 研究員 (10624611)

Project Period (FY) 2013-04-01 – 2015-03-31
Keywordsプレニルトランスフェラーゼ / 天然ゴム / セイタカアワダチソウ / 酵素機能解析
Research Abstract

セイタカアワダチソウの葉由来cDNAから、天然ゴム生合成系に必須とされるcis-prenyltransferase (CPT)、ファルネシル二リン酸合成酵素 (FPS)、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素 (GGPS)、イソペンテル二リン酸異性化酵素 (IDI) の4種類の遺伝子全長クローニングを行い、pCold ProS2ベクターに挿入して、in vitroにおけるタンパク質発現を試みた。IPTGの添加により目的タンパク質の過剰発現を行い、ニッケルアフィニティーカラムにより精製した。
FPS、GGPS、IDIに関しては、pH、触媒濃度、反応温度の検討を行い、酵素の最適反応条件を検討した後、化学反応速度論的な解析を行い、酵素のキャラクタライゼーションを行った。一方CPTに関しては、in vitroにおける酵素反応を行い、逆層薄層クロマトグラフィー (RP-TLC) により、生成物の鎖長解析を行った。その結果、開始基質としてFPPを添加したときC45・C50、GGPPを添加したときC45の主生成物が確認できた。世界的に見ても、in vitroにおけるcis-prenyltransferaseの生成物確認の事例はあまり報告されておらず、非常に大きな結果と言える。
さらにCPTに関しては、YEp352ベクターへ挿入して、RER2欠損酵母株 (SNH23-7D) に形質転換させた後、23℃または35℃で培養したときの成育差を観察した。ネガティブコントロールとしてCPTを導入していない欠損酵母株は成育できないが、CPTを導入した酵母は35℃での成育補完を示した。in vivoにおいてもCPTは酵素活性を示すことが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CPTのin vitroにおける生成物解析、in vivoにおける酵素活性を確認ができたことは非常に大きな成果といえる。その他の酵素の機能解析も完了した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、これらの遺伝子群をバイナリーベクターに導入して、アグロバクテリウムへの形質転換を行い、セイタカアワダチソウ由来カルス細胞へ感染させる。この遺伝子改変カルスからゴムを抽出して、分子量、収量等の変化を解析していきたい。

  • Research Products

    (4 results)

All 2013

All Presentation (4 results)

  • [Presentation] セイタカアワダチソウ由来ポリイソプレノイド生合成酵素系の機能解析:ゴム合成機構の解明2013

    • Author(s)
      ○中村武志, 石澤千洋, 佐々木理沙, 大谷典正
    • Organizer
      第57回香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会
    • Place of Presentation
      埼玉大学
    • Year and Date
      20131005-20131007
  • [Presentation] Catalytic activity of geranylgeranyl diphosphate synthase from Solidago altissima2013

    • Author(s)
      ○Risa Sasaki, Takeshi Nakamura, Norimasa Ohya
    • Organizer
      平成25年度日本化学会東北支部70周年記念国際会議
    • Place of Presentation
      東北大学
    • Year and Date
      20130928-20130930
  • [Presentation] Catalytic activity of farnesyl diphosphate synthase from Solidago altissima2013

    • Author(s)
      ○Chihiro Ishizawa, Takeshi Nakamura, Norimasa Ohya
    • Organizer
      平成25年度日本化学会東北支部70周年記念国際会議
    • Place of Presentation
      東北大学
    • Year and Date
      20130928-20130930
  • [Presentation] セイタカアワダチソウ由来ゴム合成関連遺伝子の全長クローニング及び酵素機能解析2013

    • Author(s)
      ○中村武志, 石澤千洋, 佐々木理沙, 大谷典正
    • Organizer
      第65回日本生物工学会大会
    • Place of Presentation
      広島国際会議場
    • Year and Date
      20130918-20130920

URL: 

Published: 2015-05-28  

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