2013 Fiscal Year Research-status Report

インスリン分泌能の指標となる新規分泌型miRNAの網羅的同定と生理的機能の解明

Research Project

Project/Area Number	25750364
Research Category	Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
Research Institution	Kamakura Women's University
Principal Investigator	伊藤太二鎌倉女子大学, 家政学部, 講師 (60343109)
Project Period (FY)	2013-04-01 – 2016-03-31
Keywords	糖尿病 / インスリン抵抗性 / インスリン分泌能 / exosome / 分泌型miRNA / マイクロアレイ
Research Abstract	本研究は、初期の2型糖尿病の増悪過程に焦点を当て、インスリン分泌能を高精度、簡便、迅速かつ低侵襲でモニターできるmiRNA マーカーの確立を目的とする。そのため、平成25年度は、糖尿病発症の初期段階と考えられる「インスリン抵抗性が惹起するインスリン分泌能低下」に関わる分泌型miRNAのマイクロアレイ法による網羅的解析を行った。具体的には、以下の3項目から成る。１．血液生化学検査に基づくインスリン抵抗性をもつ被験者の大別　インフォームドコンセントを得た被験者から採血を行い、空腹時における血糖値とIRI（血中インスリン濃度）のデータをもちいて、HOMA-IR指数を算出した。インスリン抵抗性をもつが糖尿病ではない被験者として、HOMA-IR指数が1.7以上かつ空腹時血糖値が110mg/dL未満（正常域）である被験者2名とインスリン抵抗性なしの健常被験者2名を選抜したのち採血を行い血清を分離して、２．のmiRNA抽出にもちいた。２．分泌型miRNAの抽出とmiRNAマイクロアレイによる網羅的発現解析　１．で得られた血清から、東レ社製「3D-Gene RNA extraction reagent from liquid sample kit」をもちいて、exosomeを単離後、この中に含まれる分泌型miRNAを精製した。得られた分泌型miRNAの発現量を、miRNAマイクロアレイにより網羅的に解析した（受託解析）。３．発現量変化がインスリン抵抗性獲得と高い相関性をもつmiRNAの抽出　インスリン抵抗性獲得に伴い、1.5倍以上発現が上昇あるいは低下する分泌型miRNAをクラスタリング解析により網羅的に抽出した。その結果、発現上昇するものは27種類、発現低下するものは22種類であった。現在、抽出miRNA群について、TargetscanプログラムでmiRNAの標的遺伝子予測を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当初の研究計画として、平成25年度は、インフォームドコンセントを得たヒト被験者から採血を行い、糖尿病とは診断されないが、インスリン抵抗性を獲得しているとみなされる被験者を抽出すること、こうした被験者に対し、比較対照として健常被験者からも採血を行い、血液中のexosomeを単離しこの内部に存在する分泌型miRNAを精製すること、精製した分泌型miRNAをもちいてmiRNAマイクロアレイ法により、インスリン抵抗性獲得に伴う血液中へのmiRNAの分泌量変化を網羅的に記述すること、インスリン抵抗性獲得に対して分泌量変化が高い相関性を示すような分泌型miRNAを抽出すること、を主たる計画として立案していた。これらの研究計画目標全てについて、実験を遂行し、世界でこれまで未発表の分泌型miRNAを合計49種類同定することができた。そして、現在、それらの標的遺伝子予測も順調に進行中である。従って、平成25年度の研究計画は、おおむね順調に進展していると評価できる。
Strategy for Future Research Activity	平成26年度は、平成25年度の成果をふまえ、以下の2点に焦点を当てて研究を遂行する。１．培養細胞とゼブラフィッシュ個体を用いた分泌型miRNA の標的組織および標的遺伝子の探索当初の研究計画通り、平成25年度に抽出した分泌型miRNA群について、マウスやゼブラフィッシュでも保存され発現しているかを確認する。培養細胞と生物個体をもちいて、インスリン抵抗性が惹起するインスリン分泌能低下のモデルを構築し、平成25年度に抽出した分泌型miRNAがインスリン抵抗性獲得に伴い、分泌量が変化するかを検証する。さらに、こうした分泌型miRNAの標的遺伝子予測をもとに、膵島でのインスリン生合成や分泌の過程に関わる遺伝子を標的としている分泌型miRNAを絞り込む。２．ヒト被験者数の拡充とインスリン抵抗性、および分泌能のマーカーmiRNAの絞り込み平成25年度に抽出した分泌型miRNA群は、必要最小限数の被験者から得られたデータである。従って、被験者数を拡充させ、血液検体からmiRNAの精製を行う。平成25年度に抽出した49種類の分泌型miRNAのうち1．で絞りこまれたものについて、定量的RT-PCR法をもちいて、インスリン抵抗性、および分泌能のマーカーとして使用可能か検証実験を行う。