2015 Fiscal Year Annual Research Report
生体内ＲＮＡ編集機構を利用した部位特異的変異導入法の開発
| Project/Area Number |
25750390
|
|---|
| Research Institution | Fukuoka University |
|---|
Principal Investigator |
福田 将虎 福岡大学, 理学部, 助教 (90526691)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | RNA変異導入 / RNA編集 / ガイドRNA / 分子設計 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、生体内RNA編集機構を利用した部位特異的RNA変異導入法を開発することを目的とした。前年度は、二本鎖RNA特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR2）を誘導し、標的アデノシンをイノシンに変異する機能性RNA「編集ガイドRNA」の設計方法を確立した。また、本設計に従い構築した編集ガイドRNAは、相補領域を改変することで、任意のアデノシンを標的にできることをin vitroにおいて実証した。そこで当該年度は、培養細胞内における標的RNA変異導入を達成し、編集ガイドRNAを用いた細胞内RNA変異導入法を確立することを目的とした。まず、編集ガイドRNAの細胞内編集誘導活性を評価するため、GFP mRNAのA200を標的とする編集ガイドRNAを設計し、細胞内発現ベクターを構築した。続いて、ADAR2及びGFPを発現するHEK293細胞由来の培養細胞株（tet-ADAR2細胞）に構築した発現ベクターを導入し、A200が特異的に編集されるかどうかを解析した。結果、編集ガイドRNAを発現した細胞内でのみ、A200の編集が確認された。また、その時の編集効率はおよそ40%であった。以上の結果より、編集ガイドRNAが培養細胞内においても有効であることを実証した。次に、イノシンがタンパク質翻訳の際にグアノシンとして認識されることを利用し、本RNA変異導入法が標的タンパク質機能制御へ応用できるかを検証した。具体的には、終止コドン（UAG）が編集によりトリプトファンコドン（UIG）に変換された時にのみ、GFPを発現するように設計したレポーターを細胞に導入し、RNA変異導入によるGFP発現を蛍光顕微鏡により観察した。結果、編集ガイドRNAを導入した細胞にのみGFP蛍光が観測された。上記研究を通して、編集ガイドRNAによるRNA変異導入法を開発した。
|
