2014 Fiscal Year Research-status Report
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25750393
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村田 亜沙子 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (50557121)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | マイクロRNA / 小分子化合物 / 核酸 / 発現制御 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，「Dicer によるpre-miRNA の切断効率を，小分子化合物で調節する」ことである。本研究では，RNA 中の特定の配列に結合する化合物を用いて，Dicer による切断に最適な２次構造をpre-miRNA に誘起する。これにより，pre-miRNA の切断効率を調節し，miRNA の生成量を化合物によってコントロールすることを目指す。平成２５年度において，当初使用予定であった(Z)-NCTSおよびNCDに細胞毒性があることが分かり，使用を断念した。そこで，当研究室で新規に合成されたRNDを標的とし，RNDに結合するRNA配列をin vitroセレクション法により探索し，得られた配列を本研究に利用することにした。平成２６年度は以下の３つの項目に分けて研究を進めることとした。
1. 得られた末端ループ変異体の発現ベクターを作製し，細胞内での有用性の確認：in vitroセレクションで得られた末端ループ変異体配列を導入した発現プラスミドを作製し，細胞内で変異体を発現させた。RNDの有無でmiRNAの生成量が変化するかをレポーターアッセイによって確認した。
2. 得られた末端ループの配列を基に，RND依存的にmiRNAの生成効率が変化するpre-miRNA発現プラスミドライブラリーを作製:先に得られた末端ループ配列を他のpre-miRNAに導入した場合に，RND依存的なプロセシング効率の変化が見られるかどうかを検討した。
3. 細胞内でのRND依存的にmiRNAの生成効率が変化するpre-miRNA末端ループ配列をcell-basedセレクションにより選別:RNDの結合でDicerによる切断効率が変化する末端ループ配列を，cell-basedセレクションにより得る。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 得られた末端ループ変異体の発現ベクターを作製し，細胞内での有用性の確認: おおむね順調に進展している。しかしながら，研究計画に若干の変更を加える必要があった。pre-miR-29aの配列中に，転写終結シグナルが含まれていたため，そのままの配列を使うことができなかった。そこで，得られた末端ループ変異体のステム部分の配列をpre-miR-122のステム部分の配列に置換した，pre-miR-122-loop#2を発現するプラスミドを作製した。さらに，miR-122の標的配列をルシフェラーゼ遺伝子の3’側非翻訳領域に導入したレポータープラスミドを作製した。発現プラスミド，レポータープラスミドをHeLa細胞に導入し，RND添加によるルシフェラーゼ活性の変化を調べた。しかしながら，RND添加による効果は見られなかった。
2.得られた末端ループの配列を基に，RND依存的にmiRNAの生成効率が変化するpre-miRNA発現プラスミドライブラリーを作製: おおむね順調に進展している。1.と並行して，Dicerによるpre-miRNA切断反応でもRNDの効果を評価した。先に得られた末端ループ配列を，pre-miR-29a以外のpre-miRNAのループ部分に導入した場合に，RND依存的なプロセシング効率の変化が見られるかどうかを検討した。その結果，RNDの添加でDicerによる切断反応が阻害されることが分かった。ライブラリーの作製には至らなかったが，ループ部分をセレクションで得られたループ変異体の配列に置換することで，RND依存的な切断反応のコントロールができることが示唆された。
3. 細胞内でのRND依存的にmiRNAの生成効率が変化するpre-miRNA末端ループ配列をcell-basedセレクションにより選別：やや遅れている。in vitroセレクションを優先したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度には，in vitroセレクションで得られたpre-miR-29a末端ループ変異体をもとに，細胞内でpre-miRNAループ変異体を発現する発現ベクターを調製した。pre-miRNA変異体のプロセシングに対するRND添加の効果を，レポーターアッセイにより評価した。しかしながら，細胞内ではRNDの効果が見られなかった。今後は，レポーターアッセイ以外の方法，例えばRT-PCRなどによりmiRNAの発現量を定量し，RND添加の効果を詳細に解析する。また，RND添加の効果が細胞内で見られなかった原因を突き止める。RND以外の化合物に対するpre-miRNA変異体を得るために，cell-basedセレクションシステムの構築を進める。
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| Causes of Carryover |
研究を進めるにあたり必要に応じて研究費を執行したが，研究項目の変更があり，当該年度に予定していた研究項目（細胞を用いたセレクション実験）を実施することができなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
当該年度に予定していた研究項目は次年度に実施予定であり，研究の全体計画に大きな変更はない。前年度の研究費も含め，当初予定していた計画に沿って研究を進める。
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