2015 Fiscal Year Annual Research Report
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25750393
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村田 亜沙子 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (50557121)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | マイクロRNA / 小分子化合物 / 核酸 / 発現制御 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，「Dicer によるpre-miRNA の切断効率を，小分子化合物で調節する」ことである。前年度までに，末端ループ部分の塩基配列をランダム化したヘアピン型RNAライブラリーから，当研究室で新規に合成されたRNDに結合する末端ループ配列をin vitroセレクション法により得た。得られた末端ループ配列を導入したヘアピン型RNA（末端ループ変異体）のDicerによる切断反応をRNDで制御することを試みた。平成２７年度は以下の２つの項目に分けて研究を進めた。
1. 得られた末端ループ変異体の発現ベクターを作製し，細胞内での有用性の確認: 前年度に行ったレポーターアッセイの結果から，細胞内では末端ループ変異体のDicerによる切断反応に対するRNDの効果が見られないことが分かった。この原因を調べるために，RNDの添加に伴う，末端ループ変異体のDicerによる切断産物量の変化をリアルタイムqPCRで定量した。
2. 得られた末端ループの配列を基に，RND依存的にmiRNAの生成効率が変化するpre-miRNA発現プラスミドライブラリーを作製: 前年度に行ったin vitroのDicer切断反応の結果から，ループ部分をセレクションで得られたループ変異体の配列に置換することで，RND依存的な切断反応のコントロールができることが示唆された。しかしながら，項目１で示したように，レポーターアッセイでは細胞内でRNDの効果が確認できなかった。RNDが細胞内に効果的に取り込まれていない，RNDと末端ループ変異体との結合が効果的に起こっていないなどの理由が考えられたので，RNDと末端ループ変異体との結合を表面プラズモン共鳴解析（SPR），ゲルシフトアッセイ等の手法を用いて詳細に解析した。
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