2014 Fiscal Year Research-status Report
単一細胞での膜界面における細胞外マトリックス分解反応と腫瘍細胞浸潤能の同時計測
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25810087
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
東海林 敦 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (90459850)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 表面プラズモン共鳴イメージング / カテプシン B / コラーゲン IV |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞および細胞外マトリックスで形成されるナノ空間で生じる細胞外マトリックス分解反応をモニタリングするために，表面プラズモン共鳴 (SPR) イメージング装置に着目した．SPR イメージングは数社から販売されているが，単一細胞を観察できるほど，高倍率かつ高空間分解能を有する装置は見当たらない．当該年度では，前年度作製した SPR イメージング装置を改良し，高倍率かつ高空間分解能で画像を取得できることができた．しかしながら，，倍率は固定であり，測定に熟練した技術を要するものであった．そこで，受光部に可変式のズームビームエキスパンダーの設置を試みている．一方，SPR イメージング装置の性能を評価するために，光ファイバー型 SPR 装置を作製した．両者で感度，精度の比較を行なっている．光ファイバー SPR 装置は，SPR による細胞外マトリックス分解反応のモニタリング法で得られたデータの確度を評価する上で有用であると考えている．さらに，従来の SPR 装置を用いてカテプシン B 阻害剤のスクリーニング法を構築した．本法は，数回の計測で，化合物の阻害定数 Ki を算出できる手法であった（論文投稿準備中）．
ソルバトクロミックな蛍光色素であるナイルブルーを利用した，簡便な細胞外マトリックス分解反応のスクリーニング法を構築した．細胞外マトリックスのモデルとしてゼラチンを採用し，ゼラチンに一枚膜のリポソーム (SUV) を封入した．このゲルはマイクロプレート内に作製されており，細胞外マトリックス分解酵素の存在下でゼラチンゲルが分解される．その際，SUV の脂質二分子膜内に二量体であるナイルブルーが自発的に取り込まれ（濃縮効果），単量体に変化することで蛍光を発する．酵素の活性評価は蛍光強度の増強により評価することが可能であった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本申請は，SPR によるカテプシン B 活性評価法の構築，阻害活性評価法の構築をもとに，単一細胞における細胞外マトリックス分解反応のモニタリング法を構築することである，カテプシン B 活性測定法および阻害活性測定法に関しては，構築することができた．一方，SPR イメージング装置の作製の進展はやや遅れている．本計測装置は，倍率およびステージが可変式であり，顕微鏡に近い性能を有するものである．このような装置は販売されていないだけでなく，世界的にみても投稿論文による発表例もない．そのため，本計測装置は新規な SPR イメージング装置であり，その開発に時間を要している．また，カテプシン B 活性プローブの作製に時間を費やしてきたが，現在はゼラチンゲルに封入することで，プローブと同様に，カテプシン B 活性を評価できるシステムに変更した．このシステムはほぼ完成している．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究推進方針を下記の通り，テーマ別にまとめて示した．
SPR イメージング装置の開発：ステージおよび倍率可変式のイメージング装置を開発する．カテプシン B 分解反応のモニタリング法に関しては，これまでに多くのノウハウを蓄積してきた．これらの経験をもとに単一細胞を対象とした細胞外マトリックス分解反応のモニタリング法を構築していく．
カテプシン B 阻害活性評価法：阻害活性測定法の開発に成功しているが，2~3 種類の生理活性物質に着目して，阻害定数の評価を行なっていくことが必要である．阻害定数 Ki 値を算出し，既存の測定法（ペプチド基質による評価法）と比較して確度を評価する．
光ファイバー SPR システムを用いた細胞外マトリックス分解反応の評価：光ファイバー SPR はすでに申請者は確立しており，細胞外マトリックス分解反応の計測へ応用する，SPR イメージング法で得られた結果と比較して確度を評価する．
ソルバトクロミック色素（ナイルブルー）を用いる活性評価：SUV 封入ゼラチンゲルにより，カテプシン B を活性を簡便に評価できるシステムを構築してきた．本法により，カテプシン B のみならず，マトリックスメタロプロティナーゼ 2 および 9 の活性評価も行なう．さらにカテプシン B 活性評価に用いる低分子プローブの作製も引き続き検討する．
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| Causes of Carryover |
表面プラズモン共鳴イメージング装置は完成間近である．一方，この計測装置で使用するセンサーチップ（ガラス基板に 50 nm の金が蒸着）が 100 枚につき 50 万円相当と，非常に高価格である．次年度はこのセンサーチップの使用が主となる見込みであるため，，81,474 円を次年度で使用することにした．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
7 月までに SPR イメージング装置を完成させるために，凸レンズや偏光子の購入を計画している（5 万円程度）．また，マイクロシリンジポンプ (10 万円程度）を購入する．15 万円相当になる見込みである．また，9 月にはセンサーチップを購入し，装置の性能を評価する．このセンサーチップは 50 万程度である．10 月以降はコラーゲン IV やカテプシン B 等の試薬類を購入する．残額の 20 万円程度を消耗品代として使用する予定である．
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