2013 Fiscal Year Research-status Report
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25820400
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松田 史生 大阪大学, 情報科学研究科, 准教授 (50462734)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 酵母 / 中心代謝 / Entner-doudoroff経路 / 代謝工学 |
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| Research Abstract |
平成25年度はイソブタノール生合成能が向上すると予備解析で予想されたEntner-doudoroff(ED)経路を導入した酵母株を作成した。大腸菌よりedaおよびedd遺伝子をクローニングし、多コピー型の発現プラスミドベクターへと組み込み、酵母BY4739株へと導入した。イソブタノール生産能を指標として追加導入経路の効果を確認したが明確な効果は認められなかった。そこで、他生物由来のeda, eddについてコドンユセージを最適化した遺伝子断片を合成し、ED経路と競合する反応ステップであるGND1遺伝子を破壊した酵母株に導入した結果、比増殖速度が5-8%増加した。そこで、平成２６年度に予定していた代謝フラックス解析を用いた追加反応の機能評価を前倒しして実施し、ED経路の代謝フラックス量を調べた。 [1-13C]グルコースを単独炭素源とする培地で、ED経路導入株を培養し、得られた菌体から抽出したタンパク質の酸加水分解物をGC-MSをもちいて解析し、アミノ酸の13C濃縮度を計測した。計測値を代謝モデルに当てはめて解析したところ、グルコース比消費速度に対して１％の代謝フラックスがED経路を流れていることが明らかとなった。代謝シミュレーション解析結果と比べて、代謝フラックスが低いことから、ED経路をさらに強化する必要性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
Ｈ２５年度の研究課題のうち、Entner-doudoroff(ED)経路を導入した酵母株の作成に成功し、さらに、他生物由来の遺伝子の利用、コドンユセージを最適化した遺伝子断片を合成、ED経路と競合する反応ステップであるGND1遺伝子の破壊などの改変を実施した。さらに、作成した酵母株の評価を行い比増殖速度が5-8%増加するという、導入したED経路のもつポジティブな機能を見出すことに成功した。さらに平成２６年度に予定していた代謝フラックス解析を用いた追加反応の機能評価を前倒しして実施し、ED経路の代謝フラックス量の測定を実施し、その結果と代謝シミュレーション解析結果と比べて、次の代謝改変法についても明らかにしたことから、（１）当初の計画以上に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
ED経路導入株の代謝中間体含量を測定し、代謝の律速点についての知見を得る。またED経路上流のZWF1遺伝子の発現強化株、競合反応を触媒するPFK1遺伝子破壊株を作成してED経路をながれる代謝フラックス量の向上を図る。さらにphosphoenolpyruvate decarboxylase反応などを導入した株を作成する。作成株にイソブタノール生合成に必要な遺伝子を導入する。必要なプラスミドは、過去に構築したものを利用する。得られた形質転換株を試験管(5ml)スケールで培養し、培地中イソブタノール濃度を測定して、追加反応の効果をイソブタノール生産速度と収率の観点から評価する。また、代謝フラックス解析、代謝中間体含量の測定を行い、代謝フラックス解析の結果は、代謝シミュレーション法で得た、イソブタノール生合成に最適な代謝フラックス分布と比較する。両者の違いから、次に発現を強化または抑制するべき代謝ステップに関する知見を得る。
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