2013 Fiscal Year Research-status Report
耐熱性酵素モジュールを用いた高効率物質生産プロセスの開発
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25820402
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
岡野 憲司 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (40623335)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | in vitro代謝工学 / 耐熱性酵素 / 非リン酸化Entner-Doudoroff経路 |
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| Research Abstract |
非リン酸化Entner-Doudoroff経路を構成する7種の酵素および、乳酸デヒドロゲナーゼの計8種の酵素遺伝子を種々の好熱菌のゲノムDNAより増幅し、温度誘導型ベクターであるpRCIに導入した。なおTheremoplasma acidophilum由来のグリセルアルデヒド脱水素酵素については補酵素としてNAD+を利用可能な変異酵素を利用した。得られた8種のプラスミドをそれぞれEscherichia coli Rosseta2株に導入した。
得られた形質転換体を30℃で培養後、温度を42℃にシフトさせることで発現誘導を行った。集菌後、超音波破砕、70℃・30分の熱処理により宿主由来の酵素を失活させ、粗酵素液を得た。各酵素の熱安定性を評価した結果、70℃で6時間の加熱により一部の酵素がほぼ失活した。一方60℃では全ての酵素が6時間の加熱後も60%以上の活性を有しており、以後の反応は60℃で行うこととした。また各酵素のpH依存性を評価した結果、所望の酵素活性を得るのに必要な酵素量の合算値はpH7.0で最小となることが明らかとなった。
続いて各形質転換体を70℃・30分の熱処理に供し、宿主由来酵素を失活させた酵素モジュールを混合することで、本研究のモデル反応であるグルコースからの乳酸生産を行った。反応は3時間で頭うちとなり、10mMのグルコースから12mMの乳酸を生産することに成功した。反応液のpHは5.0まで低下しており、これによる酵素の失活が反応停止の原因と考えられる。pH制御を行うことで連続的な生産が可能となると考えられる。
以上の結果から、非リン酸化Entner-Doudoroff経路のin vitro構築に成功し、必要な基質、酵素モジュール、緩衝液を混ぜるだけで物質生産が可能という生体触媒を用いた新たな物質生産のコンセプトを実証することに成功したと言える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は耐熱性酵素モジュールを用いた物質生産の生産性と経済性を向上させるために、(1)複数の耐熱性酵素を最適な量比で含有する酵素モジュールの調製技術、(2)酵素モジュール高密度充填型リアクターを用いた連続生産プロセスを開発することを目的としている。当該年度ではこれらの実施に先駆けて、モデル反応となる非リン酸化Entner-Doudoroff経路を用いたグルコースからの8段階キメラ型の乳酸生産経路を構築することを目的とした。本経路は従来の11段階からなる乳酸生産経路を大幅に短縮したキメラ型経路である。また経路内でATPおよびNAD+の使用と再生が行われるため、少量のATPとNAD+を添加するだけで連続的にグルコースから乳酸の生産が可能といった優れた特徴を有しており、これを実験的に実証することができた。
また次年度実施する複数の耐熱性酵素を最適な量比で含有する酵素モジュールの調製技術開発にあたり必要な、複数遺伝子を連結する遺伝子集積技術の習得もすでに行っている。申請者の研究グループで以前に作成したキメラ型解糖系の9つの遺伝子を単一ベクター内に集積し、大腸菌に導入することに成功している。この大腸菌を70℃・30分の熱処理に供することで宿主由来の酵素を失活させ好熱菌のキメラ型解糖系全てを単一細胞内に封入したモジュールを調製することに成功している。
以上のように、本年度の目的を達成し、次年度に向けての研究の準備も着実に進行していることから、研究は順調に進んでいると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は複数の耐熱性酵素を最適な量比で含有する酵素モジュールの調製技術の開発を行う。本研究で用いる遺伝子集積技術は単一プロモーターの下流に複数遺伝子を配置する技術であり、プロモーターからの距離に応じて発現量が減少することを利用して各遺伝子の発現量を最適化することが可能であると考えらえる。遺伝子の連結順序は原理的には8の階乗＝40320通り存在するが、これらを全て構築し、各モジュールの乳酸生産性を評価することは不可能である。従って経路を2つに分断し、それぞれについて最適化を行う予定である。
本研究で取り扱う非リン酸化型Entner-Doudoroff経路はグルコースから1分子のピルビン酸と1分子のグリセルアルデヒドを生成する工程と、1分子のグリセルアルデヒドから1分子のピルビン酸を生成する工程の2つに分断することができる。それぞれに関与する酵素はそれぞれ3つと4つである。従ってこれらの酵素の連結順序としてはそれぞれ6通り、24通りであり、実験的に検証が可能な数字である。
従って8種の酵素全てを単一細胞に封入するのではなく、3種＋乳酸デヒドロゲナーゼ、4種＋乳酸デヒドロゲナーゼを封入した2種の酵素モジュールを調製し、それぞれについて乳酸生産量を指標に、各酵素の発現量の最適化を行う予定である。これらの検討を通して、単一の細胞に複数の耐熱性酵素を発現させることで、酵素モジュールの力価が向上するかについて検討を行う予定である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当該年度において組換え体の作成並びに組換え体の有する酵素活性の評価が当初の予定より順調に進行したため、試薬・消耗品等の必要量が削減できため、予算に対して使用額が下回った。
一方で今年度は繰越金と当初予算を合わせることで、組換え体作成に使用できる試薬・消耗品等が増すため、複数酵素を同時発現する組換え体のバリエーションを増やし、より網羅的な評価を行う予定である。
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[Journal Article] Development of continuous bioconversion system using thermophilic whole-cell biocatalyst2013
Author(s)
Ninh, P. H., Honda, K. , Yokohigashi, Y. , Okano, K., Omasa, T. and Ohtake, H.
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Journal Title
Appl. Environ. Microbiol.
Volume: 79
Pages: 1996-2001
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] In vitro production of n-butanol from glucose2013
Author(s)
Krutsakorn, B., Honda, K., Ye, X., Imagawa, T., Bei, X., Okano, K. and Ohtake, H.
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Journal Title
Metabolic Eng.
Volume: 20
Pages: 84-91
DOI
Peer Reviewed
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