2013 Fiscal Year Research-status Report
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25830049
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
中牟田 信一 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (20647474)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 神経細胞 / 軸索 / 樹状突起 / TAG-1 / 神経栄養因子 |
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| Research Abstract |
本研究では神経細胞の軸索と樹状突起形成機構の解明を目的とする。生体内で神経細胞は、神経成長因子をはじめとする細胞外因子や細胞接着などの外界からの局所的な情報をもとに極性を獲得すると考えられる。申請者は、神経細胞の軸索形成に関与が示唆されているMARK2、CRMP-2と細胞外接着因子TAG-1の機能解析に焦点を絞り研究を行った。
本年度は、MARK2はCRMP-2を介した制御機構により微小管の動態を制御していることを明らかにした。次年度も、引き続きMARK2の機能解析を行っていく。さらに、細胞外因子のなかでも細胞同士の接着に関わる因子に焦点を絞り研究を行った。その結果、生体内で未熟な神経細胞は早生まれの神経細胞を足場として用いて軸索を形成すること、未熟な神経細胞の軸索形成には細胞接着分子TAG-1が必要であることを見いだし、細胞間相互作用が軸索形成に必要なことを明らかにした(難波、木部、船橋、中牟田ら、Neuron. 2014)。次年度は、培養神経細胞から生体までの解析を統合して行うことにより、包括的に神経細胞の軸索・樹状突起形成を解明を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）CaMKI-MARK2シグナル伝達に関与する分子の機能解析
カルシウムからのシグナル伝達経路が神経細胞の形態にどのように関与するのか培養細胞を使用した実験を中心に解析を行った。CRMP-2がMARK2と結合すること、MARK2がCRMP-2をリン酸化することを確認した。現在、CRMP-2のリン酸化サイトを検討中である。野生型MARK2を過剰発現することで、短いフラグメントになった微小管が増加した。さらに、これらの現象は不活性型MARK2を過剰発現することで抑制された。CRMP-2とMARK2の結合を変化されることで、微小管の形態に影響を及ぼす予備的な実験結果を得た。
２）細胞外因子による軸索誘導機構の解明
本年度は、細胞外物質であるTAG-1について解析を先行して進めた。
細胞外接着因子の１つであるTAG-1は、生体内では軸索に多く発現することが報告されているため、TAG-1の抗体を用いた免疫染色法により細胞内局在を確認した。TAG-1は、通常散在して存在しているが、神経細胞の軸索同士が接した場所でのみ軸索に濃縮して存在することを明らかにした。さらに、培養神経細胞では、早生まれの神経細胞の軸索への接触が、遅生まれの軸索形成を誘導することを明らかにした。細胞内の実験で同定されたTAG-1の生体内での時間空間的な局在や活性制御機構を検討するために、子宮内エレクトロポレーション法を用いてシグナル伝達に関わる分子のノックダウンを行い細胞の形態や遊走を検討した。その結果TAG-1の発現を抑制した神経細胞では、軸索の形成不全が誘発された。さらにTAG-1の下流分子としてSrc Familyを同定した。これらの仕事は、本年度の成果氏として報告した（Neuron. 2014）。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）細胞外因子による軸索誘導機構の解明
本年度の研究で研究の進展が認められたCRMP-2を中心に、子宮内エレクトロポレーション法を用いて生体での軸索誘導機構の解析を中心に行う。
a）軸索形成を制御するシグナル分子(CRMP-2)の可視化
培養神経細胞では、はじめに複数の未成熟な神経突起が形成される。その後、複数の未成熟な神経突起のうちの１本が急速に伸長し、軸索としての性質を獲得するようになる。これまでの研究から、神経突起に濃縮する分子として、PIP3、Rap1、Cdc42、Par6/Par3、CRMP-2などが報告されており、軸索の運命決定を担うと考えられてきた。前年度の研究より、MARK2がCRMP-2を介した微小管制御に関わっていることを明らかにした。しかしながら、MARK2がいつどのようにして活性化、もしくは濃縮するのかを観察することは技術的に難しく、軸索形成との因果関係や作用機構を解析することは困難であった。最近申請者は、マイクロピペット用いて、時空間的に軸索形成分子の活性化を制御する画期的な実験方法を確立した。この方法を用いて軸索形成を制御するシグナル分子のプローブの検討を行う。
２）軸索形成と負の制御機構の解明
申請者は、カルシウムを介したシグナル伝達経路が突起伸長を促し軸索形成を誘導することを明らかにしてきた。そのー方で軸索や伸長中の突起からカルシウム伝播が誘引され、それが複数の軸索形成を阻害する負の制御機構として働くのではないかと仮説を立てた。そこで免疫染色法や生化学的手法を用いてこれらの分子や小胞体の分布や存在量確認する。さらに、特異的阻害剤を用いたイメージングを行い、カルシウムの伝播の頻度や大きさを解析する。Caged カルシウムやCaged IP3などのCaged化合物を用い、局所でカルシウムを上昇させることで突起伸長を誘導あるいは抑制できるかを検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
実験機材の変更を余儀なくされたため、今年度計画していた液性因子による神経突起伸長効果を観察する研究が出来なかった。そのため、予定していた液性因子の購入が遅れ、金額の一部を本年度から次年度に繰り越した。研究の進行状況はおおむね好調であり、次年度は全ての金額を消費する予定である。
実験計画で記載してたように、次年度は細胞外液性因子（WntやTGF-β、IGF-1）の解析を行う予定である。これらの試薬の購入は、次年度に予定している。使用計画として、申請者が確立した単一の神経突起にのみ刺激を与える系を用いて細胞外因子からの細胞内シグナルをスクリーニングする。WntやTGF-β、IGF-1が誘導する細胞内シグナル伝達に関与する分子の特異的な阻害剤を用いて、突起伸長を誘導する細胞内シグナル伝達経路を明らかにする。さらに、そのときの軸索の形態や形成もマーカー分子の免疫染色により解析する。また、神経栄養因子とWntやTGF-β、IGF-1の相関関係についても検討する。申請者が明らかにした神経栄養機構との相関を比較検討し、機能する時期や場所、活性化などの違いを明確にして多次元での制御機構の解明を目指す予定である。
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[Journal Article] Pioneering axons regulate neuronal polarization in the developing cerebral cortex.2014
Author(s)
Namba T, Kibe Y, Funahashi Y, Nakamuta S, Takano T, Ueno T, Shimada A, Kozawa S, Okamoto M, Shimoda Y, Oda K, Wada Y, Masuda T, Sakakibara A, Igarashi M, Miyata T, Faivre-Sarrailh C, Takeuchi K, Kaibuchi K.
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Journal Title
Neuron
Volume: 81(4)
Pages: 814-829
Peer Reviewed
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[Journal Article] ERK2-mediated phosphorylation of Par3 regulates neuronal polarization.2013
Author(s)
Funahashi Y, Namba T, Fujisue S, Itoh N, Nakamuta S, Kato K, Shimada A, Xu C, Shan W, Nishioka T, Kaibuchi K.
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Journal Title
J Neurosci.
Volume: 33(33)
Pages: 13270-13285
Peer Reviewed
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