2013 Fiscal Year Research-status Report
Siglec-Hの新規ミクログリアマーカーとしての可能性とその機能に関する研究
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25830050
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
小西 博之 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90448746)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | ミクログリア / マクロファージ / マーカー / 神経損傷 / 神経再生 / モノクローナル抗体 |
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| Research Abstract |
脳に存在するミクログリアは“脳内マクロファージ”と呼ばれることもあるように、マクロファージと類似点が多い。共通の発現分子が多く、それら二種の細胞を組織学的に区別するミクログリア特異的なマーカーは発見されていない。本研究では、Siglec-Hのミクログリア特異的マーカーとしての検討とその機能解明を目標とする。
本年度、まず免疫組織化学に使用できる抗体の作成を試みた。Siglec-H細胞外ドメインのFc融合タンパク（Siglec-H-Fc）を恒常的に発現するCOS-7細胞株を作成し、その培養上清からリコンビナントタンパクを精製した。Siglec-H-Fc、またはSiglec-H細胞内ドメインの合成ペプチドを免疫したラットから、リンパ節法により、免疫組織化学でミクログリアが染色されるモノクローナル抗体を得た。次に、それらの抗体を用い、ミクログリアとマクロファージにおけるSiglec-Hの発現を比較した。運動神経切断モデルマウスにおいて、損傷ニューロンの細胞体周辺で活性化したミクログリアには明確なシグナルが見られたが、損傷軸索周辺に浸潤したマクロファージではシグナルが見られなかったため、Siglec-Hはミクログリア特異的分子であることが示唆された。
また、本年度、Siglec-Hのミクログリアにおける機能解析のため、Siglec-Hノックアウトマウスを搬入した。主に初代培養ミクログリアを用いたin vitroの実験系で、Siglec-Hの欠損がミクログリアの形態や分子発現に及ぼす影響を現在解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本実験計画にはSiglec-Hを特異的に染色できる抗体が必須である。今回、Siglec-Hの細胞外ドメインまたは細胞内ドメインを認識するラットモノクローナル抗体の作成に成功した。さらに、それらの抗体を使用し、Siglec-Hはミクログリアには発現するが、マクロファージには発現しないという、当初の予想に添う組織学的な結果を得た。Siglec-Hをミクログリア特異的マーカーと決定するためにはさらなる解析が必要ではあるが、目標達成に大きく前進したと考えられる。
機能解析に有用なSiglec-Hノックアウトマウスを入手した。順調に個体数が増えたため、形態学的手法などを用いて機能解析を始めた。解析期間が短いため、ポジティブな結果はまだ得られていないが、引き続き解析を行うことで、Siglec-Hがミクログリア特異的に発現する意義を明らかにできるのではないかと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
免疫組織化学で見られたSiglec-Hのミクログリア発現特異性を、ウエスタンブロッティングやリアルタイムPCRなどの他の手法によりまず確認する。さらに、他のアプローチも用い確認を進める。Siglec-HノックアウトマウスはSiglec-H遺伝子座にジフテリア毒素受容体がノックインされているため、ジフテリア毒素の投与により、Siglec-H発現細胞のみが死に至る。Siglec-Hノックアウトマウスへのジフテリア毒素投与により、ミクログリアは除去されるが、マクロファージは除去されないことが予想される。
前年度に引き続き、ノックアウトマウスを主に用いSiglec-Hの機能解析を行う。初代培養ミクログリアを用いたin vitroの実験系や、マウス個体を用いたin vivoの実験系で、Siglec-H欠失がミクログリアの形態や分子発現に与える影響を調べる。さらに、運動神経損傷モデルにて、Siglec-Hの機能消失が神経細胞の生存率や軸索再生に与える影響を解析する。
また、前年度作成したSiglec-H-Fcタンパクを用い、未知であるSiglec-Hのリガンドを探索する。マウス脳の膜画分から、Siglec-H-Fc結合分子をアフィニティークロマトグラフィーやFar-Western Blotting法で単離を試みる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
購入を希望していた試薬が、米国本社での在庫切れにより年度内に入手できなかった。
入手できなかった試薬の購入に充てる。
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