2013 Fiscal Year Research-status Report
piRNA経路の分子メカニズム解明と新規遺伝子ノックダウン法の開発
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25840004
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
石津 大嗣 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (40574588)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | piRNA / Piwi / RNA silencing |
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| Research Abstract |
piRNAは、相補的な配列を持つレトロトランスポゾンの発現を負に制御する生殖細胞特異的な機能性小分子RNAである。申請者らは、piRNA生合成経路及びサイレンシング機構に関する研究の過程で、人工的に配列設計したpiRNAを生成できることを見出した。本研究では、piRNA生合成経路の未だ解明されていない分子メカニズムを明らかにするとともに、これまでの研究成果で得られた人工piRNA生成システムを基盤として、miRNAやsiRNAに続く新たな小分子RNAによる遺伝子ノックダウン法への展開を目指した。
1. piRNA生成に必須のcisエレメントに相互作用する蛋白質の解析
ショウジョウバエ卵巣体細胞由来培養細胞株OSCを用いた解析から、これまでにpiRNA生合成に必須のRNA結合蛋白質として同定されていたfs(1)Ybについて、High-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation（HITS-CLIP）法を用いて結合RNAを網羅的に同定した。その結果、YbがpiRNA生成に必須のcisエレメントに相互作用するtrans因子であることが示唆された。
2.人工piRNAによる遺伝子発現抑制
OSCにおいて、任意の配列を持ったpiRNAを生成することができる発現ベクターを作製し、OSCで発現している内在遺伝子を標的としたpiRNAを人工的に生成することで遺伝子発現が抑制されるかどうかを調べた。本研究では、krimper遺伝子を標的遺伝子のモデルとして解析を行った。その結果、krimper遺伝子のサイレンシングに成功した。さらに、この抑制がpiRNA経路により転写レベルで起こることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
piRNA生合成に必須のcisエレメント配列に結合するtrans因子としてYbを同定した。また、OSCにおいて人工piRNAを発現させ、相補的な配列を持つ標的遺伝子の発現抑制に成功した。本研究の目標であるpiRNA生合成機構およびサイレンシング機構の理解にとって重要な成果が得られたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
OSCにおいてkrimper遺伝子を標的とした人工piRNAによるサイレンシングに成功したが、その他の任意の標的遺伝子でサイレンシングが可能かどうかを今後検証していく。また、人工piRNAによる転写レベルでの発現抑制がどのようなメカニズムで起こっているのかをクロマチン免疫沈降（ChIP）法を用いて明らかにしていく。得られた成果を論文として発表する。
piRNAによるサイレンシングは動物界で広く保存されている。ショウジョウバエ研究の知見を基に、その他の動物の細胞におけるpiRNA経路の解析を行う。
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