DNA高次構造が制御するMre11 complexの新規DNA切断活性の解析

2013 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 25840009
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 古郡 麻子 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (90546293)
• Project Period (FY): 2013-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: DNA修復 / DNA二本鎖切断 / Mre11 complex

Research Abstract

遺伝情報の維持伝達では、DNA複製とDNA修復の二つの機構が働いている。この重要な両機構において、Mre11 complex（ヒトMre11-Rad50-Nbs1(MRN)、酵母Mre11-Rad50- Xrs2(MRX)、古細菌Mre11-Rad50(MR)、バクテリアSbcC-SbcD (SbcCD)）が重要かつ多彩な役割を果たしていることが解ってきた。これまで多くの遺伝学的解析が行われ、その働きが明らかとなってきたが、その酵素活性の詳細を調べる生化学的解析は生体内の働きのすべてを説明するには不十分である。そこで本研究計画では、バクテリア、ヒトなどから精製したMre11 complexの詳細な生化学的解析を行うことを目的とした。まず平成25年は大腸菌SbcCDのヌクレアーゼ活性を調べることとした。様々な高次構造を持つ基質DNAに対するSbcCDの切断様式を詳細に調べて、その切断の様式を明らかにした。また温度、反応溶液の組成、濃度などの酵素反応の条件を変えることにより、様々な反応条件が活性にどのように影響するかを調べ、SbcCDの酵素活性についての基礎的な知見を得た。今後はヒトMre11 complexを精製し、同様の解析を進める予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成25年度に予定していた実験のうち、SbcCDのヌクレアーゼ活性についての解析は予定通りに進み、多くの知見を得る事ができた。しかし予定していたSbcCDのDNA相互作用についての解析は遅れており未だ大部分が実施できていない。その理由として、平成26年度に予定しているヒトMre11 complexの精製のため、各サブユニットをバキュロウイルス発現系で発現させるための準備実験を先行して開始したところ、予想以上の時間がかかったため一部の解析が遅れた事があげられる。

Strategy for Future Research Activity

今後の解析の中心はヒトMre11 complexになって行く予定であるが、平成25年度に精製準備を開始したため、既にバキュロウイルス発現系を用いたタンパク精製のためのバックミドコンストラクションはほぼ完了している。そのため、平成26年度はヒトMre11 complexを精製し、その活性を大腸菌SbcCDの解析で得られた知見と比較することを中心に行う予定である。また遅れているDNAとの相互作用解析も開始する予定である。構造解析等はそれらの生化学的解析が終了した後行いたいと考えている。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

次年度への繰り越しが生じた原因は、主には研究の進展がやや遅れている事にある。DNAとの相互作用解析（Biacore（GE Healthcare）を使用予定）のための試薬やDNAを結合させるチップ等の購入を予定していたが、平成25年中にはそれらの実験を行えなかったため、購入は平成26年度に行うこととなった。また、ヒトMre11の精製準備もやや遅れたため予算を予定通り執行できなかった。
ヒトMre11の精製準備の遅れはあるものの、精製は予定通り平成26年度初めに行うことができる見込みであることから、平成25年度に予定していた昆虫細胞やトランスフェクション試薬等といったものの購入は平成26年度前半に行うことができると考えている。また平成25年度中に行う予定であった相互作用解析に必要な試薬等の購入も、平成26年度中に行う予定である。