2013 Fiscal Year Research-status Report
分裂期の遺伝子発現制御と染色体分配におけるコンデンシンの役割
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25840013
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Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
中沢 宜彦 沖縄科学技術大学院大学, G0細胞ユニット, 研究員 (70514751)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 分子生物学 / 染色体凝縮 / 染色体分配 / 細胞周期 / 転写制御 / コンデンシン / 分裂酵母 |
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| Research Abstract |
分裂期における染色体分配は細胞の分裂・増殖に必須の生命現象であり、凝縮した染色体が構築されるとともに間期のDNA複製や遺伝子発現などの活動が抑えられると考えられている。しかし、実際には分裂期でも遺伝子の転写は活発に起こり得る状態にあり、染色体分配と転写制御は未知の仕組みによって両立していることが推測される。本研究は、染色体の凝縮・分配の中心的役割を担うコンデンシン複合体が分裂期で転写が活発な領域に蓄積しているという結果を出発点とし、「遺伝子発現制御をはじめとする分裂期染色体上での活動を維持しながら凝縮・分配させているのではないか」という新たな染色体分配メカニズムの解明を目的に研究を行っている。
本年度は、コンデンシンが転写活性化領域へ結合する仕組みを探索することを中心に進め、その領域での機能の探索まで行った。その結果、コンデンシンの転写領域への結合は、転写阻害剤存在下および分裂期の転写を制御する転写因子の遺伝子破壊株において顕著に減退することが分かった。また、分裂期の細胞にヒートショックを与え、人為的にヒートショック応答関連遺伝子の転写を活性化させたところ、該当遺伝子へのコンデンシンの結合を誘発させることができた。この結合は機能の欠損した変異型コンデンシンでは起こらなかった。さらに、GFPで転写領域の姉妹DNAを可視化したところ、コンデンシン変異体では分裂期における姉妹DNAの分離が顕著に遅延した。また、興味深いことに、その領域の転写を抑えることで分離遅延がほぼ回避された。
以上の結果は、(1)コンデンシンが分裂期の遺伝子の転写に依存してその領域に結合すること、(2)転写による染色体分配阻害効果をコンデンシンが解消しうることを強く示唆している。本年度の成果により、コンデンシンが凝縮した染色体上での転写とその領域の染色体分配を同時に可能にさせている可能性が高まった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、コンデンシン複合体がどのような仕組みで転写活性化領域へ結合し、この領域で何をしているのかを理解することを目指している。本年度は、転写阻害剤および分裂期転写因子変異体を用いて、コンデンシンがその遺伝子領域の転写に依存して結合していることを示した。また、人為的に転写誘導しコンデンシンを結合させることもできた。26年度における詳細な研究が必要であるが、本年度の結果からコンデンシン結合の仕組みの一端が理解できつつあると考えられる。
コンデンシンの機能についても、lacO/lacI-GFP可視化システムを用いた細胞生物学的手法により、染色体分配と分裂期の転写を共役させているという役割が示唆された。当初の25年度計画にあった各種変異体を用いたコンデンシン結合の解析は、技術的課題などを理由にまだ実験が残されているが、その分26年度計画に含まれていたコンデンシン機能解析を先行して進めることができている。また、26年度計画の転写量、転写終結状態の解析も少しずつ進捗しており、コンデンシン機能欠損時の遺伝子発現制御の理解が期待される。以上のことから、全体として本研究はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度は、当初の予定にある通り、分裂期に転写活性化領域へ結合するコンデンシンの役割を調べることを中心に進めたい。コンデンシンの機能を欠く分裂酵母株において、本来コンデンシンが結合する領域の転写制御の変化（転写の進行、RNA量、転写終結、染色体結合RNAなど）を詳細に解析したい。また、コンデンシン機能欠損時に転写活性化領域の分配がどうなるのかを25年度の方法を発展させて調べたい。25年度は転写活性化遺伝子の近傍を可視化してその座位の分配を観察したが、26年度は人為的に活性化遺伝子を導入した領域における染色体分配を観察する計画である。人為的に導入した転写領域の分配にもコンデンシンが必要であることを示すことができれば、分裂期の転写を可能にしつつ染色体分配を保障するメカニズムの解明が期待できる。
25年度に行うことができなかった一部の実験については、26年度で技術的改善を試みたい。とくにコンデンシン結合が失われる変異体の探索については、温度感受性変異体に代えてオーキシン誘導性タンパク質分解系を用い、標的の転写制御因子を分解させる方法を使用する予定である。この株を使用することで、変異因子の活性低下がすぐに起こらない場合でも、分解によって標的タンパクの機能を低下させることができる。実際に、数例この分解系変異体を作製済みであり、コンデンシン結合状態が転写制御因子にどう依存するのか解析を進める計画である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
当初の計画では本年度に次世代シークエンサーを利用したコンデンシン複合体の結合解析実験を多く予定していたが、技術的課題などの理由により該当実験の回数を減少させた。これにより、イルミナ社次世代シークエンサー関連試薬等消耗品の支出額が減った。一方で、特定染色体領域可視化に必要な分裂酵母株の樹立のために、オリゴDNA合成費用を多く費やした。以上の一部実験計画変更に伴い、次年度使用額が生じた。
25年度に生じた次年度使用額は、コンデンシン機能欠損株におけるRNA代謝関連の実験に必要な消耗品および試薬類の購入に充てる予定である。次年度は、転写制御の解析に必要なRNA抽出試薬、逆転写酵素、逆転写PCR関連製品の購入が多くなる見込みであるため、当初予定の26年度交付額と併せて購入の計画をしたい。また、染色体領域可視化実験も追加予定であるため、顕微鏡観察関連の消耗品や新たな分裂酵母株樹立のためのオリゴDNA合成費用も計画に入れている。クロマチン免疫沈降実験に関連する磁気ビーズや定量的PCR酵素の購入も25年度に引き続き予定している。
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Research Products
(4 results)
